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文檔簡介
1、重金屬是有毒并對環(huán)境有著持久污染的物質,重金屬可以在生物體內長期積累不可降解,在環(huán)境中可長時間結合在土壤或沉淀物中,隨著環(huán)境的變化使金屬發(fā)生移動,大大提高了它們的毒性和可吸收性。因此重金屬在環(huán)境、農產品中殘留檢測都是非常重要的。
本研究制備抗重金屬銅雜交瘤細胞株,在對其親和力、特異性進行鑒定的基礎上,克隆抗重金屬銅、汞單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因,構建抗重金屬單鏈抗體基因,利用軟件分析抗銅和抗汞單鏈抗體(ScFv)二級
2、結構和三維結構。
銅離子通過雙功能螯合劑與血藍蛋白(KLH)的偶聯(lián)物作為免疫原,免疫BALB/c鼠。采用雜交瘤技術建立能穩(wěn)定分泌高親和力抗重金屬銅單克隆抗體的雜交瘤細胞株,大量制備獲得純化的單克隆抗體,間接ELISA法檢測效價,非競爭酶免疫實驗測定親和力,競爭ELISA法測定抗體的特異性。確定抗原抗體的最佳組合,通過對離子強度、pH值優(yōu)化等研究,確定酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)的最佳工作參數(shù),建立定量測定金屬離子的間接競
3、爭ELISA方法。
選用Trizol試劑提取總RNA,通過反轉錄PCR(RT-PCR)利用重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通用引物,擴增抗體可變區(qū)基因。通過重疊延伸PCR(SOE-PCR)將兩個可變區(qū)基因通過連接肽基因連接起來,構建單鏈抗體基因,克隆到T載體中,通過PCR和測序進行鑒定。
在Discovery Studio軟件服務器上,利用同源蛋白結構預測的方法模建單鏈抗體分子結構,建立其三維結構模型,運用分子生物學、
4、分子動力學,驗證三維結構的合理性。
采用雜交瘤技術建立能穩(wěn)定分泌高親和力抗汞單克隆抗體的雜交瘤細胞株,選用汞單克隆抗體30,用Trizol試劑提取總RNA,通過RT-PCR,采用小鼠重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通用引物,擴增抗體可變區(qū)基因。通過重疊延伸PCR(SOE-PCR)將兩個可變區(qū)基因通過連接肽基因連接起來,構建單鏈抗體基因,克隆到pGEM-T載體中,通過酶切、PCR和測序進行鑒定。
在Discovery S
5、tudio軟件服務器上,利用同源蛋白結構預測的方法模建單鏈抗體分子結構,建立其三維結構模型,運用分子生物學、分子動力學,驗證三維結構的合理性。
成功建立了三株能穩(wěn)定分泌抗銅單克隆抗體的雜交瘤細胞株,獲得了高純度的單克隆抗體,選親和力高的抗體建立標準曲線,抗體DF4的IC50分別為0.671μg/mL,銅最低檢出濃度為0.014μg/mL,自來水、超純水等水樣中重金屬標準液的添加回收率介于為81.8-111.5%。從抗銅雜交
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