細(xì)小病毒B19獨特區(qū)磷脂酶A2功能初步研究.pdf

1、人類細(xì)小病毒B19于1975年由Cossart首次發(fā)現(xiàn)于英國獻(xiàn)血員中。它是目前僅有的兩種可以感染人的細(xì)小病毒，在全世界廣泛分布。它可感染各個年齡段的人群，并引起多種不同癥狀。在世界眾多地方，許多育齡婦女都是B19病毒的易感人群。如果懷孕期間感染該病毒，則可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的貧血、NIFH、胎兒損傷、胎兒死亡等一系列癥狀。B19病毒的檢測方法有電鏡觀察，B19抗原酶聯(lián)免疫，血細(xì)胞凝集測定等，目前常用的是直接雜交和PCR法。 本文中，我

2、們運用比普通單輪PCR更靈敏的巢式PCR方法檢測了共1700個血清樣本的DNA，包括從湖北省婦幼保健院采集的900個婦女及孩章血液樣本以及從武漢市第六醫(yī)院采集的800例成年人（男女均有）血液樣本。第一組（婦女組）的陽性檢測率為8.33％，第二組（普通成人，包括男性和女性）為4.50％。結(jié)果顯示，育齡婦女的B19感染率遠(yuǎn)高于普通人群，很有必要對孕婦進(jìn)行診斷從而預(yù)防新生兒感染B19病毒。 B19病毒基因組全長約5.6kb，編碼一個

3、非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，以及兩個組成病毒衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白：VP1（84kDa）和VP2（58kDa），除了VP1的N-末端多了由227個氨基酸組成的VP1獨特區(qū)外，其余部分兩者完全一致。最近對大約30種不同的細(xì)小病毒研究發(fā)現(xiàn)，VP1蛋白的N-末端獨特區(qū)有一個保守的結(jié)構(gòu)模型（HDXXY），并且具有磷脂酶A2活性，同樣的現(xiàn)象也在細(xì)小病毒B19中發(fā)現(xiàn)。磷脂酶A2已經(jīng)成為抗體藥物設(shè)計的一個潛在靶標(biāo)。因此，對細(xì)小病毒B19獨特區(qū)的研究具有重要意義，目前國

4、內(nèi)該方面的研究很少。 本實驗中，通過定點突變改變VP1蛋白獨特區(qū)的關(guān)鍵氨基酸，檢測其磷脂酶活性是否改變，從而研究該病毒獨特區(qū)的功能。本文將獨特區(qū)序列（VP1u）插入到PUC-18a載體中，重組質(zhì)粒PUC-uVP1經(jīng)PCR擴增得到突變體克隆，測序確認(rèn)后，再將包含有突變位點的獨特區(qū)構(gòu)建到表達(dá)載體pMal-c2x中，獲得重組克隆pMal-uVP1。運用此方法，順利突變了其中的133，153，174這三個關(guān)鍵氨基酸。然后在大腸桿菌中表達(dá)