17-DMAG對缺氧腫瘤細(xì)胞輻射敏感性影響研究.pdf

1、目的:
　　 本課題應(yīng)用氯化鈷建立體外人宮頸癌HeLa細(xì)胞的化學(xué)模擬缺氧模型,研究探討17-DMAG對缺氧條件下HeLa細(xì)胞輻射敏感性的影響,通過檢測不同濃度17-DMAG處理后細(xì)胞中的HIF-1α、HSP70蛋白表達(dá)情況；以及觀察17-DMAG聯(lián)合γ射線照射對缺氧處理后的HeLa細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的影響,研究17-DMAG對缺氧條件下HeLa細(xì)胞輻射敏感影響自勺作用機(jī)理。
　　 方法:
　　 利用CoCl2

2、對HeLa細(xì)胞進(jìn)行模擬缺氧處理,利用60Coγ射線對細(xì)胞進(jìn)行照射,采用Western-Blot法檢測17-DMAG對模擬缺氧條件下HeLa細(xì)胞中HIF-1α和HSP70的表達(dá)；克隆形成法測定17-DMAG聯(lián)合射線照射對缺氧條件下HeLa細(xì)胞存活率的影響；通過激光共聚焦顯微鏡觀察17-DMAG聯(lián)合射線照射對缺氧條件下HeLa細(xì)胞凋亡的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定17-DMAG聯(lián)合射線照射對缺氧條件下HeLa細(xì)胞周期阻滯的影響。
　　

3、結(jié)果:
　　 (1)Western—Blot檢測17-DMAG對HIF-1α蛋白表達(dá)影響:經(jīng)不同濃度的CoCl2作用24小時后,HeLa細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)隨著CoCl2的濃度增加蛋白表達(dá)量不斷增強(qiáng),在CoCl2濃度為200μmol／L時蛋白表達(dá)量最為明顯,因此我們選取濃度為200μmol／L的CoCl2對HeLa細(xì)胞進(jìn)行模擬缺氧處理；應(yīng)用不同濃度17-DMAG作用于CoCl2模擬缺氧處理的HeLa細(xì)胞,細(xì)胞中HIF-1α

4、蛋白隨著藥物濃度的增加,表達(dá)量逐漸降低,表明17-DMAG對HIF-1α蛋白具有表達(dá)抑制作用。同時觀察17-DMAG對HSP70蛋白的表達(dá)的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HSP70隨藥物濃度增加,表達(dá)量隨之而明顯增強(qiáng),這與HSP90蛋白表達(dá)受到抑制而誘導(dǎo)HSP70表達(dá)有關(guān)。
　　 (2)克隆形成抑制實(shí)驗(yàn)檢測HeLa細(xì)胞經(jīng)γ射線照射后細(xì)胞存活率影響,結(jié)果顯示:17-DMAG預(yù)處理HeLa細(xì)胞,不同照射劑量組間的存活率差異具有顯著性(P<0.0

5、1)。正常對照組與單純?nèi)毖踅M經(jīng)不同劑量γ射線照射后細(xì)胞存活率相比較:單純?nèi)毖踅M細(xì)胞的存活率高于正常對照組,即在缺氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞具有輻射抗拒性。缺氧藥物組(25nmol／L)濃度組細(xì)胞存活率分別為:91.11％、35.33％、12.91％、3.59％、0.4％,而缺氧藥物組濃度達(dá)到50nmol／L時,細(xì)胞存活率分別為83.89％、24.04％、6.54％、1.3％、0.08％。從劑量存活曲線中可以看出藥物照射組“肩區(qū)”明顯縮小變窄,直線

6、斜率部分增大,且各劑量點(diǎn)的存活率均低于單純?nèi)毖踅M,這表明17-DMAG可以明顯增加缺氧條件下HeLa細(xì)胞的輻射敏感性。
　　 (3)17-DMAG對γ射線照射誘導(dǎo)缺氧條件下HeLa細(xì)胞凋亡影響,結(jié)果顯示:不同濃度17-DMAG對缺氧條件下HeLa細(xì)胞凋亡影響,正常對照組與單純?nèi)毖踅M相比較,正常對照組早期凋亡率(4.33％)略高于單純?nèi)毖踅M(1.56％),但統(tǒng)計學(xué)差異不明顯(P>0.05),而17-DMAG聯(lián)合(4Gy、8Gy)射

7、線照射對HeLa細(xì)胞凋亡影響中顯示,單純照射組早、晚期細(xì)胞凋亡率(17.22％、8.67％；36％、16％)明顯高于單純?nèi)毖踅M(12％、4.22％；24.22％、8.44％),即在缺氧環(huán)境下的HeLa細(xì)胞對射線照射具有耐受性,可以保護(hù)HeLa細(xì)胞因射線導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。比較不同藥物濃度的17-DMAG預(yù)處理后經(jīng)不同劑量γ射線照射的缺氧藥物組與單純?nèi)毖踅M,結(jié)果顯示:隨藥物濃度的增加細(xì)胞早、晚期凋亡率明顯增加,并與照射劑量增高呈正相關(guān),因此,

8、我們可以推測17-DMAG能夠促進(jìn)輻射誘導(dǎo)的缺氧HeLa細(xì)胞凋亡。
　　 (4)17-DMAG聯(lián)合γ射線照射對缺氧條件下HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期分布影響結(jié)果顯示:單純藥物17-DMAG對HeLa細(xì)胞周期分布影響中,不同濃度17-DMAG處理的缺氧藥物組與單純?nèi)毖踅M相比較,17-DMAG預(yù)處理對細(xì)胞周期各期均無影響(P>0.05)；單純?nèi)毖踅M經(jīng)不同劑量γ射線(2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)照射24 h后G2／M期細(xì)胞量明顯增多,并

9、隨照射劑量的增加而不斷增高(22.02％,32.55％,42.35％,50.03％),即缺氧HeLa細(xì)胞經(jīng)射線照射后出現(xiàn)G2／M期阻滯現(xiàn)象；而不同照射劑量中,17-DMAG對因照射而導(dǎo)致的G2／M期細(xì)胞阻滯有抑制作用,因此我們可以推斷,17-DMAG對HeLa細(xì)胞的輻射增敏作用機(jī)制可能與減少細(xì)胞G2／M阻滯有關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)利用CoCl2處理細(xì)胞,可以誘導(dǎo)細(xì)胞HIF1-α過表達(dá),熱休克蛋白90(HSP90

10、)的特異性抑制劑17-DMAG可以抑制模擬乏氧細(xì)胞的HIF1-α蛋白表達(dá),同時由于抑制HSP90而導(dǎo)致HSP70過表達(dá)。
　　 (2)17-DMAG可以明顯降低γ射線照射后模擬乏氧細(xì)胞的存活率,表明:抑制HSP90可以提高乏氧細(xì)胞的輻射敏感性。
　　 (3)17-DMAG可以明顯提高γ射線照射后乏氧細(xì)胞的凋亡,并隨17-DMAG濃度越高,效應(yīng)越明顯。
　　 (4)17-DMAG預(yù)處理并不改變乏氧細(xì)胞的周期分布；γ