21-羥化酶基因新突變P459H和R483W的功能學研究.pdf

1、第一部分突變CYP21基因表達載體的構建目的： 21-羥化酶缺陷癥(21-hydroxylase deficiency，21-OHD)是最常見的先天性腎上腺皮質增生(congenital adrenal hyperplasia，CAH)，呈常染色體隱性遺傳，約占全部病例的90-95％。本課題組在2個中國漢族CAH患者家系的基因分析中檢測到兩種錯義突變，其中一個為首次報道的新突變P459H，另一個為稀有突變R483W，為明確兩個點

2、突變的意義以及進行基因型一表現型關聯分析，我們采用體外實驗的方法進行了功能學研究。首先對野生型CYP21cDNA分別進行P459H和R483W點突變，構建分別攜帶P459H和R483W突變的真核表達載體。 方法： 1．以質粒pCMV4-CYP21作為模板，分別設計兩組特異引物，用高保真PfuDNA聚合酶催化PCR反應，在野生型CYP21基因上引入突變P459H或R483W，構建分別攜帶突變CYP21的真核表達載體：pCM

3、V4-CYP21-R483W和pCMV4-CYP21-P459H。 2．產物雙向測序鑒定。 結果： 1．對突變產物進行Bgl Ⅱ和Kpn Ⅰ雙酶切，所得條帶大小約為1800bp和4800bp。 2．通過DNA雙向測序證實，除導入的特異突變位點外無其它新的突變產生，突變的pCMV4-CYP21表達載體構建成功。 結論：高保真Pfu DNA聚合酶，設計特定引物，可以成功引入目的基因突變，構建突變CYP

4、21的重組表達載體，為體外研究點突變的意義提供了基礎。 第二部分 CYP21基因突變的體外功能學研究目的： 通過體外試驗對兩個錯義突變P459H和R483W進行功能學研究，明確它們的的意義以及進行基因型一表現型關聯分析。 方法： 分別將攜帶突變P459H和R483W的表達載體--pCMV4-CYP21-P459H和pCMV4-CYP21-R483W轉染COS-7細胞，待其表達24～48h后，在培養(yǎng)

5、基中加入其天然底物孕酮，檢測產物11-DOC的產量，并計算不同CYP21蛋白催化孕酮生成11-DOC的轉化率。以WT-CYP21的孕酮轉化率作為100％，將突變CYP21的孕酮轉化率與其作比，以所得比值來表示其殘余酶活性。 結果： 1．點突變P459H和R483W都顯著降低了CYP21對孕酮的催化活性。P459H突變的CYP21在體外實驗中部分失活，殘存的催化活性為6.8％(SD=2.1％)，而R483W突變后的CYP2

6、1對孕酮的催化活性喪失至2.9％(SD=1.5％)。所有數據均經過student’t檢驗，p<0.05。 2．突變蛋白的三維結構分析顯示459位脯氨酸位于一個袢環(huán)結構，P459H導致脯氨酸被置換為組氨酸后，可能與L螺旋的氨基酸殘基LA64或Q477發(fā)生相互作用，從而在一定程度上影響蛋白功能；R483W突變導致483位的精氨酸變成色氨酸后，可能與J螺旋的322位酸性氨基酸天冬氨酸及氨基酸殘基以及L445或LA46之間的相互作用消失