直接測(cè)序法結(jié)合CNV檢測(cè)技術(shù)在Waardenburg綜合片相關(guān)基因篩查中的應(yīng)用研究.pdf

1、背景:Waardenburg綜合征（Waardenburg syndrome，WS）是最常見的常染色體顯性遺傳綜合征型耳聾，其主要臨床特征是色素沉著異常（包括皮膚毛發(fā)的色素脫失、虹膜異色）和感音神經(jīng)性耳聾。根據(jù)其他臨床特征，如內(nèi)眥異位、四肢肌肉骨骼異常、先天性巨結(jié)腸等，WS又被分為4型(WSⅠ-Ⅳ)。已報(bào)道的該疾病致病基因有6個(gè)，分別是PAX3、MITF、EDN3、EDNRB、SOX10以及SNAI2。萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心建立了關(guān)于WS的基

2、因突變數(shù)據(jù)庫LOVD-Leiden OpenVariantion Database(http://grenada.lumc.nl/LOVD2/WS/),該數(shù)據(jù)庫記錄了113個(gè)PAX3、78個(gè)SOX10、41個(gè)MITF、15個(gè)EDN3、31個(gè)EDNRB和2個(gè)SNAI2基因突變位點(diǎn)（截至2014年3月）。這些報(bào)道主要采用直接測(cè)序法篩查6個(gè)致病基因上的點(diǎn)突變或小片段的缺失，而直接測(cè)序法對(duì)于基因上可能存在的涉及較大范圍的拷貝數(shù)變異（Copy n

3、umber variation，CNV）則無法進(jìn)行可靠描述。然而，對(duì)突變準(zhǔn)確可靠的鑒別對(duì)于WS患者及家庭的遺傳咨詢十分重要。近年來，一些基于PCR的CNV檢測(cè)手段已經(jīng)廣泛使用于對(duì)目的基因的CNV檢測(cè)。國(guó)外也已經(jīng)有研究組采用多重連接依賴探針擴(kuò)增(Multiplexligation-dependent probe amplification，MLPA)技術(shù)對(duì)WS致病基因展開了篩查，我國(guó)目前還沒有此類報(bào)道。
　　目的:本研究希望通過對(duì)2

4、9例中國(guó)人群WS患者的6個(gè)致病基因的直接測(cè)序和CNV的檢測(cè)，研究中國(guó)人群WS相關(guān)基因的突變頻率及詳細(xì)的評(píng)估臨床表型，推薦合理的分子基因診斷程序。
　　方法:我們首先對(duì)新收集的4例WS病例臨床分型，采用直接測(cè)序法進(jìn)行相關(guān)基因外顯子篩查。然后，對(duì)所有WS病例（包括前期收集25例和新收的4例）采用CNVplex技術(shù)進(jìn)行致病基因的CNV檢測(cè)，對(duì)發(fā)現(xiàn)的CNV用實(shí)時(shí)熒光定量法驗(yàn)證，并初步定位。最后，總結(jié)4個(gè)新收的病例和25個(gè)前期收集的病例的臨

5、床資料以及兩種方法的檢測(cè)結(jié)果，評(píng)估臨床表型并分析突變頻率。
　　結(jié)果:本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):①新收集的4例WS病例，2例為WSⅠ型、2例WSⅡ型，均通過直接測(cè)序法找到致病突變，共發(fā)現(xiàn)3個(gè)突變。2例WSⅠ基因突變均發(fā)生在PAX3，分別為c.232G＞A和c.792+1G＞A;另外2例WSⅡ?yàn)橄嗤蛔?MITF第7外顯子c.649-651 delAGA。②包括了前期收集的29個(gè)病例中，4例WSⅠ型、23例WSⅡ、2例WSⅣ，其中所有WSⅠ型

6、和WSⅣ，以及65％(15/23)的WSⅡ型病例均通過直接測(cè)序法發(fā)現(xiàn)了突變，其中WSⅠ病例致病突變均在PAX3基因上;WSⅡ病例中39％(9/23)與MITF有關(guān)，30％(7/23)與SOX10有關(guān);WSⅣ為SOX10突變。③CNVplex檢測(cè)結(jié)果顯示29個(gè)樣本中有9例出現(xiàn)了不同目標(biāo)區(qū)的拷貝數(shù)異常。其中7個(gè)(7/29，24％)提示為點(diǎn)突變，提示位點(diǎn)與前期的直接測(cè)序結(jié)果相符。另外兩個(gè)提示為分別涉及MITF和SOX10的CNV，涉及MITF

7、的CNV拷貝數(shù)目為5（正常人為2），說明該片段存在重復(fù)，為重復(fù)型CNV;涉及SOX10的CNV拷貝數(shù)目為1，說明該片段有缺失，為缺失型CNV。經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證得到確證，并初步定位:1.涉及MITF的CNV范圍在MITF上游1 Kbp～3 Kbp到第1外顯子，大小在4～5Kbp。2.涉及SOX10的CNV是包括整個(gè)SOX10在內(nèi)的大于160Kbp的缺失。
　　結(jié)論:我們首次在中國(guó)人群中進(jìn)行WS患者的CNV研究，通過本實(shí)驗(yàn)研究的出以

8、下結(jié)論:①在中國(guó)人群中WS患者主要為WSⅠ、WSⅡ兩種亞型，分別占17％和79％，WSⅣ少見，WSⅢ在罕見。PAX3是WSⅠ的主要致病基因;MITF和SOX10是WSⅡ的主要致病突變，65％的WSⅡ發(fā)現(xiàn)與這兩個(gè)基因有關(guān);SOX10為WSⅣ的主要致病基因。②中國(guó)人群WS病例存在致病基因上的CNV，目標(biāo)基因CNV檢測(cè)可以提高WS病例的突變檢出率，與直接測(cè)序法相互補(bǔ)充。③CNVplexTM高通量基因拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)不僅可以靈敏的檢測(cè)目的基因的C