特應(yīng)性皮炎與腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及絲聚合蛋白的相關(guān)性研究.pdf

1、特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)病因與發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能是遺傳因素、免疫因素、有缺陷的皮膚屏障功能以及環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。神經(jīng)免疫因素及皮膚屏障功能障礙在AD發(fā)病機(jī)制中的作用是目前研究的熱點(diǎn)。 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain—derived neurotrophic factor，BDNF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophins，NTs)家族成員之一，除了具有營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)作用外，也是炎癥反應(yīng)過(guò)程中免

2、疫細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞間的重要調(diào)節(jié)成分。BDNF在AD發(fā)病過(guò)程中扮演重要的角色。BDNF血清水平與AD患者的疾病活動(dòng)性、嚴(yán)重性及生活質(zhì)量相關(guān)。BDNF能夠誘導(dǎo)AD患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞趨化、抑制其凋亡；抑制單個(gè)核細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子IFN—γ及IL-12的產(chǎn)生，對(duì)Th2型細(xì)胞因子IL—4、IL-10和IL-13的產(chǎn)生沒(méi)有影響，進(jìn)而導(dǎo)致Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡紊亂、增加抗原特異性IgE的產(chǎn)生。BDNF基因定位于11號(hào)染色體短臂11p13，存

3、在多種基因變異和基因多態(tài)性，C270T及G196A多態(tài)性的研究倍受關(guān)注。最近歐洲有少數(shù)BDNF基因C270T及G196A多態(tài)性與變應(yīng)性疾病相關(guān)性的研究報(bào)道，目前尚無(wú)AD與BDNF基因多態(tài)性在中國(guó)人群中的研究報(bào)道。 角質(zhì)形成細(xì)胞不僅是構(gòu)成體表的屏障，同時(shí)也是一種重要的免疫細(xì)胞，可分泌多種細(xì)胞因子、表達(dá)相應(yīng)細(xì)胞因子受體。源自角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞因子可以影響炎癥細(xì)胞的遷移、角質(zhì)形成細(xì)胞本身的增生和分化，也可增強(qiáng)或減弱其它細(xì)胞因子的分泌，

4、并輔助T細(xì)胞免疫應(yīng)答，甚至對(duì)全身免疫機(jī)能也有重要作用。角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)BDNF受體TrkB，并發(fā)生TrkB樣免疫反應(yīng)。BDNF已被證實(shí)調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖反應(yīng)，維持表皮內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定；但BDNF如何調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌免疫調(diào)節(jié)型細(xì)胞因子、參與皮膚變應(yīng)性炎癥反應(yīng)尚需進(jìn)一步研究。 絲聚合蛋白是存在于人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的一種易溶于水的蛋白，其生成的天然保濕因子(natural moisturizing factor，NMF)對(duì)保持皮

5、膚的水合作用及屏障功能至關(guān)重要。絲聚合蛋白基因(filaggrin，F(xiàn)LG)位于人類染色體1q21.3區(qū)，是表皮分化復(fù)合物基因簇的成員之一，與細(xì)胞膜形成及表皮終末分化密切相關(guān)。FLG基因突變引起的皮膚屏障功能障礙在AD發(fā)病中扮演著重要角色，絲聚合蛋白的減少和缺失，可能是引起AD等干燥性皮膚病的主要原因。R501X無(wú)義突變與2282del4移碼突變是歐洲AD人群FLG基因的主要突變位點(diǎn)；然而，F(xiàn)LG基因突變具有種族及地域差別，在亞洲及非洲

6、AD人群中，并未見(jiàn)R501X及2282del4突變。在日本AD人群中，S2554X無(wú)義突變與3321delA移碼突變?yōu)橹饕蛔兾稽c(diǎn)；但在歐洲AD人群中，未見(jiàn)S2554X與3321delA突變。目前尚無(wú)FLG基因突變?cè)谥袊?guó)AD人群的研究報(bào)道。 本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction—restriction fragment length polymorphism，PCR—R

7、FLP)結(jié)合測(cè)序(DNA sequencing)的方法檢測(cè)BDNF基因C270T、G196A位點(diǎn)多態(tài)性以及FLG基因E2422X、Q2417X、S2554X、S2889X、S3296X、R4307X無(wú)義突變和7945delA移碼突變?cè)谥袊?guó)AD人群的分布，從分子遺傳學(xué)角度探討AD的發(fā)病機(jī)制。同時(shí)，我們采用Real-Time RT-PCR及ELISA方法檢測(cè)BDNF對(duì)表皮HaCaT細(xì)胞分泌免疫調(diào)節(jié)型細(xì)胞因子IL-10、IL—6、IL-12及

8、IFN—γ的影響，以探討B(tài)DNF介導(dǎo)變應(yīng)性炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制及BDNF在AD皮損局部細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中可能發(fā)揮的作用。 材料和方法： 一、研究對(duì)象 1、病例組181例AD患者，符合Williams診斷標(biāo)準(zhǔn)。男性96例，女性85例，平均年齡12.9±13.7歲。入選患者均處于疾病活動(dòng)期，采用SCORAD評(píng)分確定疾病的嚴(yán)重程度。所有患者均為遼寧籍漢族人，彼此間無(wú)血緣關(guān)系，于就診前6個(gè)月未使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑。

9、 2、正常對(duì)照組197例健康志愿者，男性103例，女性94例，平均年齡31.5±9.4歲。已排除有過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性鼻炎及蕁麻疹、濕疹、枯草熱等異位性表現(xiàn)者，遼寧籍漢族人，彼此間無(wú)血緣關(guān)系。 以上兩組研究對(duì)象均已排除精神、神經(jīng)系統(tǒng)疾患，體重指數(shù)正常范圍內(nèi)，簽署知情同意書(shū)。 3、HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞株 二、實(shí)驗(yàn)材料 EDTA、氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、2×Taq Plus Master—Mix聚合酶、瓊

10、脂糖、8％非變性聚丙烯酰胺溶液、限制性內(nèi)切酶HinfⅠ、Ecol72Ⅰ、NlaⅢ、BfaⅠ、Hpy188Ⅰ、BamHⅠ、DpnⅡ、DdeⅠ、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、青鏈霉素溶液、胰蛋白酶、PBS、DEPC、RealMasterMix。 三、實(shí)驗(yàn)方法 1、應(yīng)用PCR—RFLP方法對(duì)BDNF基因C270T、G196A等位基因進(jìn)行分型。 2、應(yīng)用Real-Time RT-PCR及ELISA方法檢測(cè)不同濃度BDNF對(duì)

11、HaCaT細(xì)胞分泌免疫調(diào)節(jié)型細(xì)胞因子IL-10、IL—6、IL-12及IFN—γ的影響。 3、應(yīng)用PCR—RFLP結(jié)合測(cè)序的方法，對(duì)FLG基因E2422X、Q2417X、S2554X、S2889X、S3296X、R4307X無(wú)義突變及7945delA移碼突變進(jìn)行檢測(cè)。 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析過(guò)程均采用SPSS13.0軟件完成。統(tǒng)計(jì)方法主要包括X2檢驗(yàn)、單因素方差分析等，P<0.05即具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Har

12、dy—Weinberg平衡吻合性檢驗(yàn)、組間基因型頻率及等位基因頻率的差異性比較采用X2檢驗(yàn)，并以優(yōu)勢(shì)比(odds ratio，OR)及其95％可信區(qū)間(confidende interval，CI)表示相對(duì)危險(xiǎn)度。 結(jié)論： 1、BDNF基因C270T位點(diǎn)多態(tài)性與AD的發(fā)生有關(guān)，攜帶T等位基因的男性及內(nèi)源AD患者發(fā)病的危險(xiǎn)性均明顯增加。 2、BDNF基因G196A位點(diǎn)基因型及等位基因在是否伴有一級(jí)親屬異位史AD組間

13、分布具有顯著性差異，攜帶A等位基因的伴有一級(jí)親屬異位史的AD患者發(fā)病的危險(xiǎn)性增加。 3、HaCaT細(xì)胞經(jīng)不同濃度BDNF作用后，IL-10mRNA的表達(dá)量及培養(yǎng)液上清中IL-10表達(dá)水平隨BDNF作用濃度的增加呈劑量依賴性升高；IL-12mRNA的表達(dá)量及培養(yǎng)液上清中IL-12表達(dá)水平隨BDNF作用濃度的增加呈劑量依賴性降低。BDNF可能通過(guò)調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌不同的免疫調(diào)節(jié)型細(xì)胞因子，改變局部細(xì)胞因子環(huán)境，在AD患者Th1/T