補(bǔ)腎中藥對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及骨橋蛋白基因表達(dá)調(diào)控的研究.pdf

1、研究背景骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是以全身性的骨量減少，骨結(jié)構(gòu)發(fā)生退行性變，引起骨的脆性增加，骨的強(qiáng)度降低為特征的，多發(fā)于中老年人的代謝性疾病，是引起老年人腰腿痛、脊柱變形及骨折的主要病因。隨著年齡的增長(zhǎng)，人體的內(nèi)分泌代謝紊亂，鈣吸收功能下降等因素均可使OP發(fā)病率升高。我國(guó)逐漸步入老齡化社會(huì)的，OP患者將會(huì)越來(lái)越多，因此研究有效防治OP的藥物和方法是醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)。 OP主要由成骨細(xì)胞(Osteoblast，OB

2、)的骨形成功能不足和破骨細(xì)胞(Osteoclast，OC)的骨吸收功能亢進(jìn)引起的，破壞的骨質(zhì)不能及時(shí)修復(fù)，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。骨組織的修復(fù)通過(guò)骨重建來(lái)實(shí)現(xiàn)，骨重建受許多因素調(diào)節(jié)，其中非膠原蛋白在骨重建中發(fā)揮作用作用。非膠原蛋白是從礦化組織基質(zhì)中分離提純的一類(lèi)酸性糖蛋白，在生物礦化中起著重要的調(diào)控作用。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是非膠原蛋白的一種，屬于磷酸化糖蛋白，含有RGD(Arg-Gly-Asp)序列，該序列是粘附分子的

3、特有序列。含有該序列的OPN可促進(jìn)骨基質(zhì)形成、基質(zhì)礦化和礦化結(jié)節(jié)的形成。此外，OPN可促進(jìn)OC的活化，從而促進(jìn)OC的骨吸收。因此，OPN在骨重建中發(fā)揮重要作用。 骨靈丸是用于治療OP的中藥復(fù)方制劑，根據(jù)中醫(yī)理論“腎藏精，主骨，生髓”，“髓者，腎精所生，精足則髓足，髓足骨內(nèi)，髓足者則骨強(qiáng)”而組方的，Ⅰ主要有鹿茸、鹿角膠、菟絲子、骨碎補(bǔ)等補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨中藥組成。經(jīng)過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及多年的臨床應(yīng)用證實(shí)骨靈丸具有良好的抗骨質(zhì)疏松作用，但骨靈丸

4、抗骨質(zhì)疏松具體機(jī)制尚未清楚。鑒于OB、OPN在骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的重要作用，因此，從骨靈丸對(duì)OB的生物學(xué)功能的影響及對(duì)OPN基因表達(dá)調(diào)控來(lái)研究其抗骨質(zhì)疏松機(jī)理。 研究目的1、建立分離和培養(yǎng)OB的最優(yōu)方法； 2、探討補(bǔ)腎中藥血清對(duì)體外培養(yǎng)的OB生物學(xué)作用的影響及OPN基因表達(dá)的調(diào)控； 3、在OB-OC共同培養(yǎng)體系中探討骨靈丸對(duì)OB部分生物學(xué)功能的影響及OPN基因表達(dá)的調(diào)控，以探討補(bǔ)腎中藥在不同培養(yǎng)體系中對(duì)OPND基因表

5、達(dá)的調(diào)控與礦化結(jié)節(jié)形成之間的關(guān)系。 方法1.選擇新生的SD乳鼠頭顱骨，應(yīng)用改良的胰酶-膠原酶消化法分離OB，并結(jié)合骨片貼塊法培養(yǎng)OB，采用細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞酶化學(xué)方法鑒定培養(yǎng)的OB； 2、運(yùn)用血清藥理學(xué)的方法對(duì)補(bǔ)腎中藥血清在細(xì)胞水平上抗骨質(zhì)疏松機(jī)制的研究； 3.在不同的培養(yǎng)體系探討含補(bǔ)腎中藥血清血清對(duì)OB的生物學(xué)作用及OPN基因表達(dá)調(diào)控的研究； 4.實(shí)驗(yàn)分五組：補(bǔ)腎中藥血清高劑量組(highdoses，H

6、D)、補(bǔ)腎中藥血清中劑量組(Middledoses，MD)、補(bǔ)腎中藥血清低劑量組(Lowdoses，LD)、空白血清對(duì)照組(Control)、陽(yáng)性對(duì)照組(17-β雌二醇組，Estrol，E2)； 5.應(yīng)用對(duì)硝基苯酚法、流式細(xì)胞技術(shù)、四唑鹽比色法(MTT)和茜素紅染色法對(duì)含骨靈丸血清作用OB后的堿性磷酸酶(AlkalinePhosphatase，ALP)活性、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡、增殖及礦化功能進(jìn)行測(cè)定； 6.運(yùn)用免疫印跡(

7、Western-blot)檢測(cè)OPN表達(dá)，應(yīng)用半定量RT-PCR方法對(duì)OPN的基因表達(dá)進(jìn)行分析； Ⅱ7.采用SPSS10.0(R)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果1.OB的鑒定：(1)形態(tài)學(xué)鑒定：細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或三角形貼壁生長(zhǎng)，HE染色可見(jiàn)細(xì)胞胞體較大，邊界清晰，胞漿呈深紅色，細(xì)胞突起的長(zhǎng)短與數(shù)量不等，胞核偏位、呈圓或橢圓形、偶有雙核型，核染色質(zhì)深、呈粗糙疏松網(wǎng)狀，核仁1～2個(gè)，呈藍(lán)色，初步證實(shí)此為OB； (

8、2)細(xì)胞酶化學(xué)鑒定：將細(xì)胞進(jìn)行ALP染色，并運(yùn)用免疫組化的方法檢測(cè)OB的I型膠原，均呈陽(yáng)性反應(yīng)，此為OB的特征性表現(xiàn)，從而進(jìn)一步鑒定為OB，細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)95％以上，提示細(xì)胞的純度較高。 2.經(jīng)各種處理因素作用的體外培養(yǎng)的OB生物學(xué)供變化如下：(1)補(bǔ)腎中藥血清高劑量組、中劑量組和雌二醇組均可使OB的增殖率升高、細(xì)胞周期中的(G2+S)期細(xì)胞比率增加、細(xì)胞凋亡減少、細(xì)胞ALP活性增強(qiáng)、礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)量增加，與空白對(duì)照組比較均有顯著

9、性差異(P＜0.01)； (2)補(bǔ)腎中藥血清低劑量組可促進(jìn)細(xì)胞增殖、增強(qiáng)細(xì)胞ALP活性，與空白對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05)； (3)雌二醇組對(duì)OB在促進(jìn)細(xì)胞增殖作用比補(bǔ)腎中藥血清各劑量組明顯(P＜0.05)； (4)半定量RT-PCR分析OPN的基因表達(dá)結(jié)果如下：補(bǔ)腎中藥高劑量組、中劑量組、雌二醇組的OPN基因擴(kuò)增量/β-actin擴(kuò)增量OD比值與空白對(duì)照組比較升高具有顯著性差異(P＜0.01)；高劑量

10、組、中劑量組與雌二醇組之間的比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，提示骨靈丸高劑量組、中劑量組與雌二醇組可促進(jìn)OPN基因的表達(dá)。 3、各處理因素作用的在共育體系中的OB各指標(biāo)變化如下：(1)補(bǔ)腎中藥高劑量組、中劑量組和雌二醇組增強(qiáng)ALP活性、促進(jìn)OB礦化結(jié)節(jié)形成，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異(P＜0.01)；低劑量組與空白對(duì)照組比較增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；高、中劑量組和雌二醇組之間比較Ⅲ差異有顯著性(P＜0.05)。雌

11、二醇組增強(qiáng)ALP活性、促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)形成作用比其它各組明顯。 (2)OB的OPN基因表達(dá)：補(bǔ)腎中藥高劑量組、中劑量組、E2組的OPN基因的擴(kuò)增量/β-actin的擴(kuò)增量的OD比值與空白對(duì)照組比較升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；高劑量組、中劑量組與雌二醇組之間的比較有顯著性差異(P＞0.05)，雌二醇組上調(diào)OPN基因的表達(dá)較其他各組明顯。 (3)共育體中OB的鈣結(jié)節(jié)結(jié)節(jié)數(shù)目與單獨(dú)培養(yǎng)的OB相應(yīng)各組比較降低18％-25％；

12、OPN基因表達(dá)量與單獨(dú)培養(yǎng)的OB相應(yīng)各組比較降低約18％-30％左右；共育體中的ALP活性比單獨(dú)培養(yǎng)的OB相應(yīng)各組升高18％-25％。 結(jié)論1、利用改良的胰酶-膠原酶消化法及骨片培養(yǎng)相結(jié)合的方法成功培養(yǎng)出數(shù)量大、純度高OB，能夠滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求的。 2、補(bǔ)腎中藥血清可促進(jìn)OB分化成熟及礦化結(jié)節(jié)的形成，具有促進(jìn)OB的骨形成功能。 3、構(gòu)建OB-OC共育體系，在共育體系中骨靈丸血清具有促進(jìn)OB分化及及成熟功能，并促進(jìn)鈣結(jié)