AMPK活化在H2S拮抗阿霉素誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、研究背景與目的：
　　阿霉素是惡性腫瘤治療的常用藥，但其心肌毒性作用是導(dǎo)致腫瘤患者擴(kuò)張型心肌病乃至心力衰竭的重要原因。阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡在其心肌毒性效應(yīng)中扮演了重要角色。研究阿霉素心肌毒性的作用機(jī)制及其干預(yù)方法，對擴(kuò)張型心肌病和心力衰竭的防治具有重要的理論與應(yīng)用價值。硫化氫被認(rèn)為是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第三個內(nèi)源性氣體信號分子。研究表明，硫化氫對心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。單磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monop

2、hosphate activated protein kinase，AMPK)不僅是細(xì)胞內(nèi)能量傳感器和調(diào)節(jié)器，也是細(xì)胞內(nèi)的壓力傳感器。AMPK可通過調(diào)節(jié)活性氧/氧化還原反應(yīng)平衡、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞增殖等反應(yīng)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。本研究以AMPK為切入點，旨在探討硫化氫拮抗阿霉素誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的新作用機(jī)制。
　　方法：
　　采用MTT法檢測H9c2心肌細(xì)胞活力；Hoechst33258染色后，熒光顯微鏡下觀察H9c2心肌細(xì)胞

3、核染色體形態(tài)改變；2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)染色后，熒光顯微鏡檢測 H9c2心肌細(xì)胞內(nèi) ROS水平，并采用 Image-Pro Plus軟件半定量分析熒光強(qiáng)度平均值；Western Blot測定H9c2心肌細(xì)胞中p-AMPK、AMPK和p53蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.采用不同濃度的阿霉素（0、0.25、0.5、1、2、5μmol/L）處理 H9c2心肌細(xì)胞。細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果表明，阿霉素

4、呈濃度依賴性降低細(xì)胞活力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，本實驗發(fā)現(xiàn)5μmol/L阿霉素誘導(dǎo) H9c2心肌細(xì)胞凋亡最為明顯。
　　2.選擇不同濃度的NaHS（0、25、50、100、200μmol/L）預(yù)孵育H9c2心肌細(xì)胞30min后，再用阿霉素誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，NaHS呈濃度依賴性拮抗阿霉素誘導(dǎo) H9c2心肌細(xì)胞凋亡，以100μmol/LNaHS拮抗阿霉素誘導(dǎo)H9c2的心肌細(xì)胞凋亡最為明顯。
　　3

5、.細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對照組、5μmol/L DOX組、100μmol/L NaHS＋5μmol/L DOX組和5mmol/L PPG＋5μmol/L DOX組。測定H9c2心肌細(xì)胞中p-AMPK、AMPK和p53蛋白的表達(dá)及ROS水平，分析H2S含量的變化對阿霉素誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，NaHS+DOX組p-AMPK/AMPK比值為DOX組的1.4倍（p＜0.05)，PPG+DOX組p-AMPK/AMPK比值較DOX組

6、降低了40.7％（p＜0.05）；與DOX組相比，NaHS＋DOX組p53蛋白表達(dá)降低了51.4%（p＜0.05），而PPG＋DOX組p53蛋白表達(dá)增加了8.3%（p＜0.05）；與DOX組相比，NaHS+DOX組ROS水平降低了40%（p＜0.01），PPG+DOX組ROS水平升高了14.1%（p＜0.05）。提示H2S抗阿霉素誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡可能與其活化AMPK和降低p53蛋白表達(dá)及ROS水平有關(guān)。
　　4.采用AM

7、PK抑制劑compound C預(yù)先處理H9c2心肌細(xì)胞。細(xì)胞隨機(jī)分為5組：對照組、5μmol/L DOX組、100μmol/L NaHS＋5μmol/L DOX組、10μmol/L compound C＋100μmol/L NaHS＋5μmol/L DOX組和10μmol/L compound C＋5μmol/L DOX組。分析AMPK被抑制后，H2S抗阿霉素誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡的作用是否有變化。結(jié)果表明，與NaHS+DOX組相比，

8、compound C＋NaHS+DOX組p-AMPK/AMPK比值降低了25.8%（p＜0.05）。compound C＋NaHS+DOX組p53蛋白表達(dá)量、細(xì)胞ROS水平和細(xì)胞凋亡率分別為NaHS+DOX組的1.9倍（p＜0.05）、1.4倍（p＜0.05）和1.6倍（p＜0.05）。結(jié)果表明compound C抑制了H2S對阿霉素誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞中AMPK的活化作用以及對p53蛋白表達(dá)和ROS水平的降低作用。
　　結(jié)論：<