ZFP580在TGF-β1抗化學性缺氧誘導的H9c2心肌細胞損傷中的作用.pdf

1、目的:缺氧是許多臨床常見疾病的共同病理生理過程，當機體尤其是心臟和大腦等重要器官遭受嚴重缺氧時甚至會導致死亡。氯化鈷作為一個廣為人知的缺氧模擬劑，它可以通過增加活性氧(Reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生、降低細胞活力、改變線粒體膜電位、激活Caspase-3和誘導凋亡產(chǎn)生缺氧/缺血性應答。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一種具有多種生物學活性的細胞

2、外分泌型信號多肽，可以通過調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、黏附、移行及凋亡，在生物體的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。TGF-β1在心臟保護中的作用也一直是研究的熱點，諸多報道表明其在心肌細胞損傷中通常扮演抗凋亡的角色。大鼠ZFP580是由本組克隆的一種C2H2型鋅指蛋白，前期研究表明TGF-β1可誘導其表達，且ZFP580在缺氧/復氧損傷誘導的H9c2心肌細胞損傷中具有促進細胞存活及抗凋亡等細胞保護作用。然而，ZFP580在H9c2心肌細胞缺氧損傷中是

3、否具有類似作用及具體機制，以及是否受到TGF-β1的調(diào)控仍不清楚。
　　本實驗擬通過氯化鈷處理H9c2心肌細胞建立化學缺氧誘導的細胞損傷模型，探究ZFP580在TGF-β1抗H9c2心肌細胞缺氧損傷保護效應中的作用及具體機制。
　　方法:MTT法檢測細胞存活率;Real time-PCR測定ZFP580和HIF-1α的mRNA表達水平;Western-blot檢測ZFP580、HIF-1α、Smad2、Smad3、p-Sma

4、d2、p-Smad3、Bax、Bcl-2和Active Caspase-3的蛋白表達;AnnexinⅤ-FITC/PI法檢測細胞凋亡;DCFH-DA檢測活性氧生成;使用SB431542阻滯劑及慢病毒干擾技術(shù)后檢測相關指標。
　　結(jié)果:
　　1氯化鈷處理降低細胞存活率并上調(diào)ZFP580和HIF-1α的表達
　　氯化鈷可呈時間和劑量依賴方式降低細胞存活率。給予H9c2心肌細胞不同劑量的氯化鈷(400、600、800、100

5、0μM)處理24 h，細胞存活率隨著氯化鈷濃度的升高而降低，結(jié)果顯示600μM氯化鈷處理24 h時細胞存活率接近50％。然后使用600μM氯化鈷分別處理細胞0、4、8、12、16、20和24 h，發(fā)現(xiàn)細胞存活率與對照組相比在8、12、16、20和24 h顯著降低(P＜0.05)。實時定量RT-PCR和Western blot的結(jié)果顯示，氯化鈷能在mRNA和蛋白水平促進ZFP580的表達，其mRNA表達高峰在12h早于蛋白質(zhì)表達水平的峰值

6、16h。而HIF-1α蛋白迅速積累且表達峰值在12h，但在mRNA水平?jīng)]有發(fā)現(xiàn)HIF-1α的顯著改變。
　　2 TGF-β1減弱氯化鈷誘導的細胞毒性并上調(diào)ZFP580蛋白的表達
　　為了進一步探討在缺氧狀態(tài)下TGF-β1的作用，在暴露于氯化鈷相應時間前給予TGF-β1預處理。MTT實驗結(jié)果表明與各自相對應的單純?nèi)毖踅M相比，TGF-β1預處理16h和24 h明顯減弱氯化鈷誘導的細胞毒性，提高細胞存活率達到約10％(P＜0.05

7、)。Western blot結(jié)果顯示常氧條件下TGF-β1刺激8、16和24 h后ZFP580的表達顯著升高。同時，我們注意到暴露氯化鈷處理前使用TGF-β1預處理也可以誘導ZFP580蛋白表達的上調(diào)。與各自相對應的單純?nèi)毖踅M相比，TGF-β1預處理8h和24 h處ZFP580的表達上調(diào)明顯改變，尤其是在24 h時間點處(P＜0.05)。然而，在16h時間點上，TGF-β1預處理的細胞與單純?nèi)毖醯募毎g沒有觀察到ZFP580表達的差別

8、。
　　3抑制Smad2/3的活化減弱ZFP580蛋白表達和TGF-β1介導的抗氯化鈷誘導細胞凋亡的保護作用
　　使用公認的TβR1-Smad2/3選擇性抑制劑SB431542給予H9c2心肌細胞預處理，然后在暴露于氯化鈷前予以TGF-β1刺激。結(jié)果表明SB431542能部分阻斷TGF-β1誘導的ZFP580表達上調(diào)。另一方面，流式細胞術(shù)的結(jié)果表明，與單純?nèi)毖踅M相比，TGF-β1預處理可以顯著降低的凋亡細胞的比例(P＜0.0

9、5);與DMSO對照組相比，抑制Smad2/3的活化會使凋亡細胞的比例增加(P＜0.05)。
　　4 ZFP580在TGF-β1抗氯化鈷誘導的細胞凋亡和ROS生成中的作用
　　為了探討ZFP580在抗氯化鈷誘導的細胞凋亡TGF-β1/Smad2/3信號傳導途徑中的作用，我們通過轉(zhuǎn)染ZFP580干擾慢病毒下調(diào)ZFP580的表達，然后在暴露于氯化鈷前對細胞使用或不使用TGF-β1預處理。流式細胞儀結(jié)果表明，RNA干擾ZFP580

10、組與陰性對照組相比，細胞凋亡比例顯著增加(P＜0.05);當轉(zhuǎn)染過的細胞在暴露于氯化鈷之前預先用TGF-β1處理，RNA干擾ZFP580抑制其表達會明顯減弱TGF-β1的抗凋亡效果，凋亡細胞的比例顯著增加(P＜0.05)。共聚焦顯微鏡和酶標儀的結(jié)果表明，缺氧條件下RNAi-ZFP580組與陰性對照組相比，細胞的活性氧顯著積累(P＜0.05)。同時TGF-β1預處理可以減少氯化鈷誘導的ROS生成。
　　5 ZFP580通過抑制線粒體

11、凋亡途徑參與了TGF-β1的抗凋亡作用
　　我們進一步探討了ZFP580通過TGF-β1/Smad2/3信號傳導途徑抗氯化鈷誘導細胞凋亡的具體機制。蛋白印跡的結(jié)果表明細胞預處理TGF-β1后，促凋亡分子Bax和活化的Caspase-3表達以及Bax/Bcl-2比率顯著降低，抗細胞凋亡的分子Bcl-2表達顯著增高（P＜0.05）。同時，通過RNA干擾ZFP580抑制其表達后，TGF-β1的抗凋亡效果會被明顯減弱，Bax/Bcl-2比