肺炎支原體23S rRNA基因2617突變的研究.pdf

1、研究背景：
　　 肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，MP)是介于細(xì)菌與病毒之間的一類無(wú)細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型生物。能在體外生存而不依靠活細(xì)胞，能夠自我復(fù)制。主要通過呼吸道傳播，兒童和青年人易感，一般為散發(fā)或小流行，一年四季均可發(fā)病，多在秋季暴發(fā)，流行趨勢(shì)為每3-7年在全球流行，在人群密集處如學(xué)校發(fā)病率高，在家庭成員中易相互傳染。從近年來(lái)流行的報(bào)道可以看出MP肺炎發(fā)病率有上升趨勢(shì)，占各類肺炎總數(shù)的8.5％～27.9

2、％，而且在小年齡兒童呼吸道感染中也較常見，MP對(duì)人類健康的威脅已不容忽視。重癥肺炎支原體肺炎表現(xiàn)為大量胸腔積液、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、肺纖維化，阻塞性細(xì)支氣管炎等，而且常常伴隨肺外表現(xiàn)[1]，如腦炎、心肌炎，肝炎、腎炎等，嚴(yán)重威脅兒童的身心健康，甚至危及生命。早期診斷和治療顯得非常重要。
　　 MP缺乏細(xì)胞壁這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使其對(duì)影響細(xì)胞壁合成的抗生素具有本質(zhì)耐藥性。臨床治療MP感染主要選擇抑制或影響蛋白質(zhì)和核酸合成的藥

3、物，如大環(huán)內(nèi)酯類，四環(huán)素類、氨基糖苷類、喹諾酮類。由于兒童處于生長(zhǎng)發(fā)育期，能夠用于治療兒童MP感染的藥物選擇更少，目前首選大環(huán)內(nèi)酯類藥物，主要為14元環(huán)的紅霉素和15元環(huán)的阿奇霉素。而四環(huán)素類、氨基糖苷類和喹諾酮類由于副作用的原因，已極少用于兒科臨床。
　　 隨著大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的廣泛使用，已有越來(lái)越多關(guān)于MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的報(bào)道。我們?cè)谂R床上也常發(fā)現(xiàn)大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療無(wú)效的病例，這些病例經(jīng)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療后，體溫不

4、降，咳嗽和肺部炎癥無(wú)好轉(zhuǎn)，易合并胸腔積液和肺不張，需要調(diào)整藥物治療。
　　 細(xì)菌藥物研究較早，有了很多發(fā)現(xiàn)。但由于MP生長(zhǎng)緩慢、培養(yǎng)周期長(zhǎng)和需要特殊培養(yǎng)基，體外分離培養(yǎng)比較困難，以往MP感染的診斷多依賴血清學(xué)檢查，因此藥物敏感性研究報(bào)道較少。PCR技術(shù)是20世紀(jì)分子生物學(xué)的重大發(fā)現(xiàn)，可以迅速獲取大量的單一核酸片段，使人們能通過試管內(nèi)的數(shù)小時(shí)反應(yīng)將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍，具有操作簡(jiǎn)便易行、檢測(cè)周期短和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，所以近年

5、來(lái)該方法得到了發(fā)展。
　　 目前國(guó)內(nèi)外的報(bào)道認(rèn)為MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥與結(jié)合位點(diǎn)的基因突變密切相關(guān)，其中以23SrRNA基因的2063(相當(dāng)于大腸桿菌2058)、2064(相當(dāng)于大腸桿菌2059)位點(diǎn)變異報(bào)道較多。MatsuokaM[2]等報(bào)道在日本分離76株耐藥MP中分離出13株對(duì)紅霉素耐藥，其中12株高度耐藥，10株在2063位發(fā)生A到G突變，1株在2064位發(fā)生A到G突變，對(duì)紅霉素低耐藥株在2617位發(fā)生C到G突變；

6、在體外分離的MP紅霉素耐藥株中，1株出現(xiàn)2617位C到G的點(diǎn)突變，1株出現(xiàn)2064位A到C點(diǎn)突變、2617位C到A點(diǎn)突變。國(guó)內(nèi)XinD等報(bào)道[3]，46株大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的耐藥機(jī)制與2063，2064位點(diǎn)突變有關(guān)。然而，目前為止，國(guó)內(nèi)尚未有關(guān)2617位點(diǎn)突變情況的研究報(bào)道。
　　 本課題利用多聚酶鏈反應(yīng)對(duì)肺炎支原體含有2617位點(diǎn)的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，將其與MP標(biāo)準(zhǔn)敏感株M129核苷酸序列進(jìn)行比較。并對(duì)MP肺炎患兒的臨

7、床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析2617位點(diǎn)突變情況及與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性的相關(guān)性。
　　 目的：
　　 研究臨床分離的MP23SrRNA基因2617位點(diǎn)突變情況。了解該位點(diǎn)突變與MP肺炎大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性的相關(guān)性。
　　 方法：
　　 本研究以2009年4月～2010年4月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院呼吸科因MP肺炎住院235例患兒的鼻咽吸出物(NPA)作為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行MP23SrRNA基因檢測(cè)并測(cè)

8、序，并對(duì)臨床資料進(jìn)行分析。
　　 1、收集患兒的NPA：所有235例患兒均于入院當(dāng)天采集NPA，密封送檢，標(biāo)本立即用于測(cè)試或保存于-20℃待測(cè)，保存期不超過一周，提取MPDNA，進(jìn)行熒光定量PCR。選取經(jīng)PCR熒光探針法測(cè)定濃度1.0×104以上(包括1.0×104)NPA作為下一步實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，12000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘離心后取上清于1.5ml離心管中放入-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?br>　　 2、應(yīng)用PCR擴(kuò)增：從美國(guó)國(guó)立生物信

9、息中心(NCBI)檢索MP23SrRNA基因序列，根據(jù)國(guó)外研究報(bào)道的突變熱點(diǎn)區(qū)即23SrRNA的2617位兩側(cè)自行設(shè)計(jì)PCR引物，對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，用以檢測(cè)是否存在目的片段。
　　 3、MP23SrRNA基因測(cè)序：經(jīng)電泳檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本經(jīng)乙醇純化后作雙脫氧末端終止法全自動(dòng)DNA測(cè)序，測(cè)得序列與NCBI已登錄的MP標(biāo)準(zhǔn)株(M129)23SrRNA基因作比對(duì)，每次試驗(yàn)設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
　　 4、臨床資料比較：采集并

10、比較MP23SrRNA基因發(fā)生突變組和未發(fā)生突變組的MP肺炎的性別、年齡、臨床表現(xiàn)、并發(fā)癥、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、胸部X線的特點(diǎn)及治療情況等。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以-x±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組采用方差分析，繼以LSD兩兩比較。計(jì)數(shù)資料比較采用)χ2檢驗(yàn)，以P<0.05表示為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、本地區(qū)分離MP株與MP標(biāo)準(zhǔn)株(M129)23