植物RNA分離與Northern雜交方法的改進及質(zhì)體信號對核基因表達和葉片形態(tài)建成的影響.pdf

1、本論文對植物RNA分離和Northern雜交分析RNA的方法進行了改進。并研究了質(zhì)體信號對定位于不同細胞器的核基因表達的調(diào)節(jié)以及葉片形態(tài)建成的影響。 第一部分，建立了一種高效經(jīng)濟的植物RNA提取方法。在提取緩沖液中加入蔗糖、氯化鉀和鎂離子以提供對RNA分子的保護。破碎后的細胞于提取緩沖液中裂解后，用酚/氯仿變性并去除內(nèi)源RNA酶和其他蛋白質(zhì)，而后用pH5.6的NaAc沉淀RNA。用該方法提取RNA的得率較高，經(jīng)電泳檢測，RNA的

2、完整性很好。RNA印跡分析和RT-PCR也都得到很好的結(jié)果。該方法還使實驗成本大大降低。 第二部分，系統(tǒng)地考察了溴化乙錠(ethidiumbromide，EtBr)先染RNA對RNA熒光強度產(chǎn)生影響的因素。所得結(jié)果顯示出，RNA的熒光強度除受先前報道的EtBr濃度影響外，還受變性溫度、變性時間和RNA量的影響。由于經(jīng)EtBr先染的RNA的Northern雜交效率與RNA的熒光強度呈負相關(guān)，因而對于一個特定的Northern雜交程

3、序的設(shè)計，上述這些影響染色靈敏性的因素必須要同時考慮，以使染色的靈敏性與雜交效率得到很好的結(jié)合。當使用異源DNA為探針時，隨著RNA樣品中EtBr濃度的升高，Northern雜交效率要比用同源RNA探針降低得快。我們提出，對于在分子生物學(xué)中經(jīng)常用到的異源DNA探針與EtBr先染的RNA所作的Northernz雜交，最好的結(jié)果是當先染RNA的EtBr濃度不超過30μg/mL。這一濃度要低于使用同源RNA探針時的50μg/mL的EtBr濃度

4、。 第三部分，考察了葉綠體發(fā)育缺陷的葉綠素(Chlorophyll，Chl)減少的突變體油菜Cr3529中Lhcb基因表達及Chl生物合成前體物質(zhì)的含量。所得結(jié)果顯示出，四葉期突變體油菜中LhcbmRNA含量高于野生型，但Lhcb基因表達的光響應(yīng)性、節(jié)律性以及組織特異性都沒有發(fā)生改變。表明Cr3529中與葉綠體發(fā)育狀態(tài)一致的光合核基因的協(xié)調(diào)表達受到影響。對Chl生物合成前體物質(zhì)的測量結(jié)果顯示出：Cr3529Chl的生物合成部分的

5、阻斷于合成的早期，這導(dǎo)致了進入到Chl生物合成途徑的卟啉底物原卟啉Ⅸ和Chl生物合成的第一步特異性反應(yīng)的產(chǎn)物鎂原卟啉Ⅸ的含量都有降低。我們討論了Lhcb基因表達在LHCⅡ生物發(fā)生和天線大小控制方面的作用。通過將Cr3529中卟啉含量及光合核基因轉(zhuǎn)錄本水平與其它的抑制劑和突變體中的研究結(jié)果比較，表明原卟啉Ⅸ和鎂原卟啉Ⅸ的水平在調(diào)節(jié)光合核基因表達中具有特異性作用。我們提出它們的水平被Mg-螯合酶的催化亞基，H亞基以連續(xù)的方式感知，并將這一信

6、號傳遞到細胞核，使光合核基因的表達與葉綠體的功能狀態(tài)協(xié)調(diào)起來。 第四部分，考察了質(zhì)體信號對質(zhì)體和非質(zhì)體光合功能蛋白編碼核基因和線粒體蛋白編碼核基因表達以及葉片形態(tài)建成的影響。在葉綠體發(fā)育缺陷的突變體油菜Cr3529中，編碼質(zhì)體蛋白的核基因Lhcb1和RbcS，編碼過氧化物酶體乙醇酸氧化酶的核基因GLO以及線粒體交替氧化酶核基因Aox1的轉(zhuǎn)錄本都被維持著至少與野生型相當?shù)乃?。而用質(zhì)體蛋白翻譯抑制劑林可霉素抑制葉綠體發(fā)育后，野生型

7、油菜中這3類基因的轉(zhuǎn)錄本水平都降低，而GLO受抑制的程度最小。在葉綠體發(fā)育同樣被抑制的突變體油菜中，這3類基因表達的抑制被解除，其轉(zhuǎn)錄本水平都至少是林可霉素處理的野生型油菜中的2倍。這些結(jié)果表明，Cr3529中調(diào)節(jié)質(zhì)體和非質(zhì)體功能蛋白編碼核基因以及線粒體蛋白編碼核基因表達的質(zhì)體信號受到了損傷，而且編碼定位于不同細胞器蛋白的核基因?qū)|(zhì)體結(jié)構(gòu)與功能狀態(tài)的敏感性不同。Cr3529子葉發(fā)育初期的形態(tài)學(xué)觀察也顯示出差異，表現(xiàn)為細胞排列方式以及細胞