熒光HBV病毒體的形態(tài)學鑒定及在活細胞中的研究.pdf

1、目的：制備雙砷染料標記的熒光乙型肝炎病毒（hepatits B virus,HBV）體，對其形態(tài)學進行鑒定分析，并動態(tài)觀察HBV熒光體在活細胞中的生物學行為。
　　 方法：采用脂質體介導的方法，將已成功構建帶有TC 標簽的1.3倍乙型肝炎病毒基因組的載體質粒（pTHBV1.3-mTC1）瞬時轉染入人肝癌細胞株中，該重組載體是通過PCR定點基因突變技術將一個能與雙砷熒光染料特異性結合的TC 標簽（C-C-P-G-C-C)在基因水平

2、上插入到HBV 核心蛋白免疫主區(qū)c/el 位點。48h后通過間接免疫熒光檢測表面抗原在細胞內的表達與分布；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測細胞培養(yǎng)上清液中乙肝表面抗原(HBsAg)的表達；同時收集轉染細胞上清液，經不連續(xù)蔗糖密度梯度離心進行分離和純化后，加抗體孵育進行免疫電鏡觀察分析，同等培養(yǎng)條件下HepG2細胞和2.2.15細胞培養(yǎng)上清液分別作為陰性和陽性對照?；罴毎芯恐?，我們應用Oregon Green 488 Taxol 標記

3、微管骨架后，在活細胞時差共聚焦顯微鏡下觀察熒光HBV 病毒體在宿主細胞中的運輸過程。
　　 結果：間接免疫熒光結果顯示在轉染pTHBV1.3-mTC1組細胞中雙砷的紅色熒光強于轉染pTHBV1.3細胞組，呈典型的核漿型分布。電鏡結果顯示，轉染pTHBV1.3組細胞在48h 時可表達HBsAg 并可自行組裝成12nm 左右的球形顆粒后分泌至上清中，而陰性對照組和pTHBV1.3-mTC1組未見到與文獻報道一致的HBV 顆粒樣結構。

4、活細胞時差共聚焦顯微鏡觀察顯示熒光HBV 顆粒感染HepG2細胞后約3h 熒光顆粒開始吸附并侵入胞內，約5h 時在胞漿中富集而少數(shù)已到達核周，并可觀察到熒光HBV顆粒依賴于微管的運動。初步證實重組的HBV 熒光體同野生型HBV 一樣保留了抗原性和感染性。
　　 結論：TC嵌合型核心蛋白在轉染pTHBV1.3-mTC1細胞中能夠特異性的發(fā)出熒光，且TC標簽的插入并不影響表面抗原及核心蛋白的表達。雙砷復合物這一新穎熒光標記技術使得H