a1，3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因靶向的RNA干擾抑制豬內(nèi)皮細(xì)胞異種抗原性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分小分子干擾RNA轉(zhuǎn)染豬內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)化體系的建立 【目的】本研究擬探索建立高效、穩(wěn)定的小分子干擾RNA(smallinterferingRNA,SiRNA)轉(zhuǎn)染方案并建立優(yōu)化的豬內(nèi)皮細(xì)胞RNAi轉(zhuǎn)染體系，為研究RNAi在抑制異種排斥反應(yīng)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 【方法】針對豬體內(nèi)存在的a1，3-GT基因的不同外顯子設(shè)計(jì)并生物合成數(shù)對SiRNA分子(SiRNA-1、SiRNA-2及錯(cuò)配SiRNA)，運(yùn)用不同脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體系(D

2、OSPA、RiboJuice及Lipofectamine2000)分別轉(zhuǎn)染原代PEC和永生化豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系SV-40-PED。分別應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)檢測、臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)及乳酸脫氫酶釋放試驗(yàn)評價(jià)干擾a1,3-GT作用下PEC的a-Gal表達(dá)情況以及RNAi脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對PEC生長的影響。 【結(jié)果】原代PEC及內(nèi)皮細(xì)胞系SV-40-PED均可有效發(fā)生特異性RNAi現(xiàn)象，且呈明顯的劑量依賴性特征。SiRNA-1與脂質(zhì)體RiboJuice在

3、12nmol：6μl時(shí)干擾效果最佳(67.3％～89.5％)，整體量效優(yōu)于DOSPA及Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染體系，2種靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染SiRNA-1后48h時(shí)的a-Gal相對表達(dá)水平分別為14.3％(原代PEC)和10.5％(SV-40-PED)，而SiRNA-2轉(zhuǎn)染組則未見明顯干擾現(xiàn)象。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體系在轉(zhuǎn)染后6～12h對靶細(xì)胞生長稍有影響，24h后細(xì)胞活性逐漸得以恢復(fù)。 【結(jié)論】豬內(nèi)皮細(xì)胞存在RNAi機(jī)制，RiboJ

4、uice轉(zhuǎn)染體系是一種高效、低毒的SiRNA轉(zhuǎn)染方式，為進(jìn)一步研究RNAi(RNAinterference)在抑制異種排斥反應(yīng)中的應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。 第二部分a1，3-GT基因沉默的豬內(nèi)皮細(xì)胞抗人血清補(bǔ)體細(xì)胞毒作用的功能研究 【目的】本研究旨在進(jìn)一步評價(jià)RNAi對豬內(nèi)皮細(xì)胞a1,3-GT基因及a-Gal蛋白表達(dá)的影響，以及探討a1,3-GT基因沉默的豬內(nèi)皮細(xì)胞是否具有抗人血清補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。 【方法】分

5、別使用RT-PCR、Westernblot及免疫熒光檢測各轉(zhuǎn)染組a1,3-GTmRNA及a-Gal蛋白表達(dá)，確認(rèn)豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系SV-40-PED發(fā)生了RNAi效應(yīng)。在流式細(xì)胞學(xué)檢測中觀察a-Gal表達(dá)下調(diào)對SV-40-PED結(jié)合抗體/補(bǔ)體能力的影響，并通過標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放試驗(yàn)評價(jià)RNAi對人血清細(xì)胞毒效應(yīng)的保護(hù)作用。 【結(jié)果】與錯(cuò)配組及空轉(zhuǎn)染組相比，SiRNA-1轉(zhuǎn)染組a1,3-GT基因的2個(gè)異構(gòu)體mRNA表達(dá)量分別下降了69

6、.0％和72.6％(P＜0.05)，而SiRNA-2轉(zhuǎn)染組a1,3-GT表達(dá)量的差異無顯著性意義(P＞0.05)。Westernblot和免疫熒光再次確認(rèn)SV-40-PED在特異性SiRNA作用下發(fā)生了RNAi效應(yīng)，蛋白電泳圖譜顯示分子量在66kDa～200kDa范圍的蛋白質(zhì)表達(dá)水平均有不同程度的下降，且66kDa～116kDa范圍的蛋白質(zhì)降低程度更為顯著，幾乎為痕量表達(dá)。SiRNA-1轉(zhuǎn)染組a-Gal平均熒光強(qiáng)度(52.9)明顯小于錯(cuò)

7、配組(493.9，P＜0.01)及空轉(zhuǎn)組(505.7，P＜0.01)，陰性對照ECV304細(xì)胞因無a-Gal表達(dá)呈現(xiàn)暗色背景。流式細(xì)胞學(xué)檢測中，SiRNA-1組與空轉(zhuǎn)染組相比，無論抗體還是補(bǔ)體結(jié)合水平均有不同程度的下降，抗體/補(bǔ)體下降程度依次為IgG44.8％，IgM68.1％和C3c51.4％(P＜0.05)。20％正常人血清(normalhumanserum，NHS)及40％NHS對空轉(zhuǎn)染組和錯(cuò)配組SV-40-PED均有不同程度的殺

8、傷能力，而SiRNA-1轉(zhuǎn)染SV-40-PED后即可呈現(xiàn)出對此效應(yīng)的保護(hù)作用，抑制補(bǔ)體介導(dǎo)細(xì)胞毒的效應(yīng)分別為：20％NHS，69.5％；40％NHS，59.8％(P＜0.05)，使補(bǔ)體對SV-40-PED的殺傷率大幅度下降?？辙D(zhuǎn)染組和錯(cuò)配組間殺傷率無明顯差異(P＞0.05)，熱滅活正常人血清(heat-inactivatedNHS，HINHS)作為陰性對照對各組SV-40-PED均表現(xiàn)出背景毒性作用。 【結(jié)論】盡管未取得完全的a

9、-Gal沉默效應(yīng)，但短暫的a-Gal合成下調(diào)已能足夠抑制體外補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)，為抑制超急性排斥反應(yīng)的研究提供了新的思路和策略。 第三部分a1，3-GT基因沉默對豬內(nèi)皮細(xì)胞和人自然殺傷細(xì)胞相互作用的影響 【目的】本研究擬檢測RNAi對豬內(nèi)皮細(xì)胞和人自然殺傷細(xì)胞(naturalkiller,NK)相互作用的影響，探討NK細(xì)胞直接殺傷豬內(nèi)皮細(xì)胞作用的靶位點(diǎn)，觀察RNAi可能存在的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。 【方法】分別從

10、粘附作用和殺傷效應(yīng)的角度探討RNAi對豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系SV-40-PED和人NK細(xì)胞系NK92相互作用的影響，并通過二者共培養(yǎng)上清的IFN-γ分泌水平評價(jià)NK92的活化狀態(tài)。 【結(jié)果】SV-40-PED轉(zhuǎn)染SiRNA分子后48h，無論在靜止還是流動(dòng)狀態(tài)下，NK92在SiRNA-1轉(zhuǎn)染組、錯(cuò)配組及空轉(zhuǎn)染組對SV-40-PED細(xì)胞的粘附能力均無明顯差異，3組NK92粘附細(xì)胞的數(shù)量分別為262±26、275±24和252±23(靜止?fàn)?/p>

11、態(tài)，P＞0.05)；132±12、125±15和110±20(流動(dòng)狀態(tài)，P＞0.05)。無論TNF-a刺激SV-40-PED與否，NK92對3組不同SV-40-PED的殺傷率在相同效靶比下無明顯區(qū)別，但殺傷能力與效靶比成正相關(guān)。NK92與SV-40-PED共孵育早期即有反應(yīng)性的IFN-γ分泌，其分泌水平較其自發(fā)分泌值增加了5倍(60.1±6.4pg/mlvs366.9±28.7pg/ml)。IFN-γ分泌達(dá)峰時(shí)間在共孵育后12h出現(xiàn)，隨

12、后IFN-γ表達(dá)逐漸下降。SiRNA-1轉(zhuǎn)染組、錯(cuò)配組及空轉(zhuǎn)染組在不同時(shí)間段的IFN-γ分泌值組間差異無顯著性意義(P＞0.05)。 【結(jié)論】利用RNAi技術(shù)下調(diào)a-Gal后，并未引起NK92和SV-40-PED相互作用的明顯改變。a-Gal可能并非是NK作用的靶位點(diǎn)，其表達(dá)量的高低對NK細(xì)胞的活化、粘附及殺傷能力不產(chǎn)生負(fù)性影響。NK細(xì)胞直接作用于豬內(nèi)皮細(xì)胞的配體-受體學(xué)研究尚需更多、更直接的實(shí)驗(yàn)材料來證實(shí)。 第四部分

13、RNA干擾聯(lián)合低劑量GS-IB4凝集素誘導(dǎo)體外Accommodation模型的建立 【目的】本實(shí)驗(yàn)在前部分利用RNAi技術(shù)成功沉默豬內(nèi)皮細(xì)胞a1,3-GT基因、減少a-Gal表達(dá)的基礎(chǔ)上，試圖在體外模擬異種移植物內(nèi)皮細(xì)胞與人血清相互作用的過程，通過a-Gal特異性結(jié)合凝集素GS-IB4的刺激，探討誘導(dǎo)適應(yīng)現(xiàn)象發(fā)生的可行性。 【方法】SiRNA-1轉(zhuǎn)染SV-40-PED后分別使用不同劑量GS-IB4(0.5、2和8μg/m

14、l)刺激SV-40-PED4h，另設(shè)未轉(zhuǎn)染SiRNA-1而單獨(dú)接受不同劑量GS-IB4刺激SV-40-PED作對照組。分別以51Cr釋放試驗(yàn)及抗體/補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)觀察SV-40-PED在正常人血清中適應(yīng)現(xiàn)象的發(fā)生，并通過檢測SV-40-PED細(xì)胞E-selectin及HO-1基因的表達(dá)，探討體外內(nèi)皮細(xì)胞適應(yīng)發(fā)生的可能機(jī)制。 【結(jié)果】聯(lián)合RNAi和低劑量GS-IB4刺激SV-40-PED可以明顯抑制補(bǔ)體介導(dǎo)對內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。這

15、一效應(yīng)與單獨(dú)使用RNAi相比，效果進(jìn)一步增強(qiáng)。GS-IB4濃度在2μg/ml時(shí)即可呈現(xiàn)最大保護(hù)效應(yīng)，20％NHS和40％NHS對SV-40-PED的特異性殺傷率分別為4.3％±0.8％和8.4％±2.3％(P＜0.01)。對照組單獨(dú)使用GS-IB4劑量達(dá)到24μg/ml時(shí)，其抑制補(bǔ)體的細(xì)胞毒作用才具有顯著性意義。流式細(xì)胞學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)SV-40-PED結(jié)合抗體/補(bǔ)體水平與GS-IB4的刺激無關(guān)。SV-40-PED轉(zhuǎn)染SiRNA-1后接受HI

16、NHS刺激時(shí)的E-selectin表達(dá)水平與正常SV-40-PED接受HINHS刺激相比無明顯差異(MFI：232.5vs201.8)，但如果聯(lián)合使用GS-IB4預(yù)處理SV-40-PED，E-selectin表達(dá)則受到抑制，且其表達(dá)下調(diào)呈明顯的GS-IB4劑量依賴性，其MFI值從0.5、2和8μg/ml依次為98.5、42.0及36.3。保護(hù)性基因HO-1的mRNA表達(dá)則在聯(lián)合RNAi和低劑量GS-IB4處理后有明顯的上調(diào)。 【