重組鼠抗人CD19單鏈抗體的構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、兒童急性白血病是嚴(yán)重危害兒童健康的頑癥，聯(lián)合化療是目前治療該疾病的主要方法。急性B淋巴細(xì)胞白血病(B系A(chǔ)LL)是兒童白血病中的常見類型。CD19分子是一個(gè)B細(xì)胞系特異的細(xì)胞表面分化抗原，在B祖細(xì)胞階段出現(xiàn)并穩(wěn)定持續(xù)地·表達(dá)，在B系A(chǔ)LL的陽性表達(dá)率達(dá)99.1％，而在髓系細(xì)胞、紅系細(xì)胞、T細(xì)胞、造血干細(xì)胞以及非造血組織器官細(xì)胞上無表達(dá)。因此，抗人CD19抗體可能是一個(gè)生物靶向治療B系A(chǔ)LL的良好制劑。 本實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)基本確

2、定了2E8抗體輕、重鏈可變區(qū)基因(簡稱VL2E8和VH2E8)序列，用DNASISver2.5軟件對該基因進(jìn)行分析和國際互聯(lián)網(wǎng)檢索，表明它們符合鼠免疫球蛋白可變區(qū)基因的開放閱讀框，但對其是否就是原抗體可變區(qū)的編碼基因序列尚未證實(shí)。本研究擬采用RT-PCR、TA克隆、抽提質(zhì)粒、酶切連接等一系列分子生物學(xué)方法克隆ScFV2E8基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體pSectag2A/ScFV2E8，并通過轉(zhuǎn)染建立轉(zhuǎn)基因中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞株，表達(dá)獲得

3、ScFV2E8抗體蛋白并初步鑒定其生物活性，為該抗體進(jìn)一步進(jìn)行人源化基因改造奠定基礎(chǔ)。材料與方法 1、雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)：按照常規(guī)方法進(jìn)行。 2、VH2E8、VL2E8及ScFv2E8基因的克隆與測序：收集處于對數(shù)生長期的2E8雜交瘤細(xì)胞1x107，PBS離心(1500rpmx5min)洗滌2次后，用Trizol試劑盒按說明抽提總RNA，采用帶有特定酶切位點(diǎn)的引物和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和重疊延伸拚接法

4、(splicingbyoverlapextension，SOE)擴(kuò)增VH2E8、VL2E8和ScFv2E8基因，將目的基因片斷通過TA克隆的方法對其進(jìn)行測序核實(shí)。 3、分泌型真核表達(dá)載體的構(gòu)建：將位于TA克隆載體pGEM(R)-Teasyvector中并業(yè)已測序核實(shí)的ScFV2E8基因通過酶切處理后得到的ScFV2E8基因片段和pSectag2A空載體片段，經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化、篩選、抽提質(zhì)粒、酶切鑒定等步驟后，測序核實(shí)，第2頁從而獲

5、得重組質(zhì)粒pSectag2A/ScFv2E8。 4、轉(zhuǎn)基因CHO細(xì)胞株的建立：通過Superfecttransfectionreagent轉(zhuǎn)染試劑盒將pSectag2A/ScFv2E8穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞CHO細(xì)胞中，并用Zeosin進(jìn)行培養(yǎng)篩選，從而獲得帶有重組質(zhì)粒(pSeectag2A/ScFv2E8)的轉(zhuǎn)基因CHO細(xì)胞株CHO/pSectag2A/ScFv2E8。 結(jié)論1、本研究成功克隆到2E8抗體的VH2E8和VL