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1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文鼠抗人CD14新克隆ZCH72F9單鏈抗體的研究姓名:寧鉑濤申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:博士專業(yè):兒科學(xué)(血液腫瘤學(xué))指導(dǎo)教師:湯永民20050501浙江大學(xué)博士學(xué)位論文鼠抗人CDl4新克隧ZCH一7—2F9單鏈抗體的研究和輕鏈可變區(qū)(VL)基因進(jìn)行克隆測(cè)序,并將2F9單抗制各成,j、分子抗體ScFV2F9對(duì)這一抗體片段進(jìn)行了純化、復(fù)性和體外活性的研究。一、2F9單抗輕重鏈可變區(qū)基因克隆與序列分析復(fù)蘇并亞克隆2F9雜交瘤細(xì)胞株,獲
2、得高純度的細(xì)胞株93A10采用反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR),從93A10雜交瘤細(xì)胞中克隆到了該抗體的VH和VL基因,TA克隆并測(cè)序分析。VL”9基因全長(zhǎng)321bps,VH2F9基因全長(zhǎng)360bps,分別編碼107和120個(gè)氨基酸殘基?;ヂ?lián)網(wǎng)在線分析結(jié)果表明:VL2F9含有明確的4個(gè)框架區(qū)(FR)和3個(gè)抗原決定簇互補(bǔ)區(qū)(CDR),在第23位和第88位為特征性半胱氨酸:VH2F9含有明確的4個(gè)框架區(qū)和3個(gè)抗原決定簇互補(bǔ)區(qū),在第22位和
3、第96位為特征性半胱氨酸。二、ScFv2F9原核和真核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)VH2F9、VL2F”(G4S)3基因序列以及空載體多克隆位點(diǎn)內(nèi)切酶的核酸序列設(shè)計(jì)引物,采用高保真的Taq酶,通過重疊延伸拚接法(splicingbyoverlapextension,SOE)擴(kuò)增克隆到ScFv2F9基因,測(cè)序核實(shí)后分別克隆到pIVE)(23一MCS和pSecta92A空載體中,成功構(gòu)建了ScFvm的原核表達(dá)載體plVEX23MCSIScFv2F9和
4、真核分泌型表這載體pSecta92A/ScFV2F9。三、直標(biāo)鼠抗人CDl4新克隆2F9FITC的研制及鑒定在清潔級(jí)BALB/c小鼠腹腔注射2F9細(xì)胞,制備大量腹水。硫酸銨初步純化后采用EconoPac蛋白A柱進(jìn)行親和層析,SDSRAGE檢測(cè)純化蛋白的純度。將獲得的純化2F9單抗,通過改良Marsshall法,用異硫氰酸熒光囊(Fluoresceinisothiocyanate,F(xiàn)rrC)進(jìn)行標(biāo)記,多余FITC經(jīng)PBS充分透析除去,用紫
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