柔嫩艾美耳球蟲(chóng)轉(zhuǎn)染中穿梭載體的構(gòu)建.pdf

1、轉(zhuǎn)基因技術(shù)在頂復(fù)器門(mén)原蟲(chóng)的研究中得到了日漸廣泛的應(yīng)用，成為揭示此類(lèi)原生動(dòng)物生物學(xué)特征的重要工具。與剛地弓形蟲(chóng)、瘧原蟲(chóng)相比，艾美耳球蟲(chóng)由于自身特點(diǎn)的制約，其轉(zhuǎn)基因研究相對(duì)比較落后。探索構(gòu)建含有報(bào)告基因的穿梭載體，通過(guò)轉(zhuǎn)染在球蟲(chóng)中實(shí)現(xiàn)報(bào)告基因的瞬時(shí)高效表達(dá)，并進(jìn)一步建成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，意義深遠(yuǎn)。這類(lèi)基因操作一旦成功，將揭示球蟲(chóng)生物學(xué)中不為人知的一面，預(yù)示著一種新型的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)生，有助于完善球蟲(chóng)病及其它相關(guān)疾病的防治措施。 本

2、試驗(yàn)的目的是構(gòu)建用于柔嫩艾美耳球蟲(chóng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的穿梭載體。以真核表達(dá)載體pd2EYFP-N1為原始載體，用PCR法擴(kuò)增并克隆了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)組蛋白4、熱激蛋白70基因的5'UTR和肌動(dòng)蛋白基因的3'UTR，將其分別作為黃色熒光蛋白報(bào)告基因的上下游調(diào)控序列，構(gòu)建了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染用的重組穿梭載體，即以單個(gè)黃色熒光蛋白編碼區(qū)或兩個(gè)串聯(lián)的黃色熒光蛋白編碼區(qū)作為報(bào)告基因，并通過(guò)電轉(zhuǎn)染分別轉(zhuǎn)染了Vero細(xì)胞和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子囊。轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，兩個(gè)串聯(lián)起來(lái)的