不結球白菜分蘗性狀的發(fā)生機理及其候選基因挖掘.pdf

1、不結球白菜(Brassica rapa ssp.chinensis Makino)原產中國，是十字花科蕓薹屬中重要的蔬菜作物之一。不結球白菜可以分為五大類，分別是:1.普通白菜var.communis(Tsen et Lee) Hanelt，2.塌菜var.rosularis(Tsen et Lee)Hanelt，3.菜薹vat.parachinensis(L.H.Bailey) Hanelt，4.薹菜var.tai-tsai Hort

2、.，5.分蘗菜var.multicepsHort.。其中分蘗菜表現(xiàn)為特殊的多頭分枝特性，在營養(yǎng)生長階段即有大量側枝形成，狀如分蘗，又叫多頭菜。本研究主要以分蘗菜品種‘馬耳頭’和普通白菜品種‘蘇州青’為研究材料，對分蘗菜的多頭分枝特性進行觀察，解剖，測定內源激素含量變化，探討其發(fā)生機理。構建F2分離群體，利用高通量測序技術進行分蘗性狀相關的候選基因的挖掘。研究內容如下:
　　1不結球白菜分蘗性狀的特點
　　不結球白菜的多數(shù)品種

3、在開花期會有大量側枝從莖基部（一級分枝）及葉腋之間（二級分枝）抽出，一般在營養(yǎng)生長期無側枝形成。但不結球白菜變種之一的分蘗菜在營養(yǎng)生長階段即有側芽從短縮莖基部和成葉間的葉腋處長出，進一步伸長生長發(fā)育成為由多片小葉組成的分枝。形態(tài)學觀察表明，營養(yǎng)生長達到一定階段（10-12片），不結球白菜分蘗菜中的側芽開始形成并長出，直到每一個葉腋處都有一個側芽并最終長成分蘗，具有一片成葉對應一個分蘗的特點。組織切片觀察顯示，‘蘇州青’和‘馬耳頭’都有腋

4、分生組織的形成，但形成時期略有不同。‘蘇州青’中腋分生組織形成后進入休眠狀態(tài)而‘馬耳頭’中腋分生組織形成后無休眠過程直接繼續(xù)發(fā)育并進一步形成分蘗。生殖生長開始后，‘蘇州青’中的腋芽結束休眠也開始向外生長，形成側枝后開花結果。成株期部分營養(yǎng)品質含量測定結果顯示，分蘗菜的硝態(tài)氮、可溶性蛋白和VC含量都顯著高于普通白菜。
　　2激素對不結球白菜分蘗性狀的影響
　　利用酶聯(lián)免疫反應法(ELISA)測定‘馬耳頭’和‘蘇州青’內源激素含

5、量結果顯示:生長素主要參與了‘蘇州青’中側芽的休眠，抑制側芽向外生長，是‘蘇州青’中頂端優(yōu)勢現(xiàn)象起主要作用的激素;細胞分裂素在‘馬耳頭’分蘗發(fā)生過程中起主要促進作用。對‘馬耳頭’的根部外施細胞分裂素(6-BA)和獨腳金內酯（GR24），處理6天后發(fā)現(xiàn)，獨腳金內酯抑制側芽的發(fā)生和生長而細胞分裂素促進側芽的發(fā)生和伸長。Q-PCR結果顯示，細胞分裂素響應基因BcRR4和BcRR5在‘馬耳頭’中的增加量顯著高于‘蘇州青’中的增加量，說明‘馬耳頭

6、’對細胞分裂素的響應更敏感;BcBRC1基因在‘馬耳頭’中的表達量顯著低于‘蘇州青’中的表達量，說明在“細胞分裂素-獨腳金內酯調控莖分枝”這一抑制分蘗發(fā)生的調控途徑中，‘馬耳頭’響應機制劣于‘蘇州青’。
　　3兩雜交組合6個遺傳群體的數(shù)量遺傳學分析
　　利用分蘗親本‘馬耳頭’、‘如皋毛菜’和不分蘗親本‘蘇州青’構建遺傳群體(P1、P2、F1、F2、BC1和BC2)，對分蘗數(shù)和葉片數(shù)進行主基因+多基因的混合遺傳模型分析。結果顯

7、示不結球白菜分蘗數(shù)和葉片數(shù)均符合E-1混合遺傳模型，受2對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因控制。分蘗性狀不僅受兩對主基因控制，也受更多微效多基因的遺傳影響。F2中主基因加多基因的遺傳率達到61.58％～96.83％，說明分蘗數(shù)和葉片數(shù)主要由遺傳因素控制，環(huán)境對分蘗數(shù)和葉片數(shù)的影響穩(wěn)定而微效。遺傳率的高低決定選擇世代的早晚，高遺傳率說明早期選擇是有效的。
　　4利用F2群體進行BSA-簡化基因組測序分析及SSR分子標記開發(fā)

8、
　　測定1000株F2群體的分蘗數(shù)，選取分蘗數(shù)分別為0、1-2、5-6、8-9和≥10各50株抽提DNA，形成五份DNA混池并利用限制性內切酶Eco RⅠ+MseⅠ酶切后測序。利用分布在全基因組的SNP標記對五種DNA池進行基因型鑒定，篩選在若干DNA混池之間存在多態(tài)性差異的標記(Marker)，根據這些標記進一步確定與分蘗相關的候選區(qū)域，對區(qū)域內基因進行注釋和q-PCR篩選，進一步確定用于做功能驗證的基因。根據簡化基因組測序的

9、結果進行與分蘗性狀相關的分子標記的開發(fā)，得到9對SSR分子標記。其中有8對能在親本中擴增出較為清晰的條帶，有效引物比例為90％，其中編號為Bra028643、Bra023312、Bra002958和Bra002957的基因對應的4對引物在親本中表現(xiàn)出穩(wěn)定的多態(tài)性,SSR標記引物開發(fā)成功率為50％。
　　5不結球白菜分蘗性狀轉錄組學分析
　　將‘蘇州青’和‘馬耳頭’兩個時期的根(R)、莖尖(SAM)和葉片(L)共計12個樣本進

10、行了無參轉錄組測序并組裝成一套參考序列。獲得了總長為120，205，788nt的119，237個Unigenes，其中得到注釋的基因共計104，086(87.29％)。獲得了32，065個SSR標記位點。KEGG數(shù)據庫注釋得到3，768(6.25％)個涉及到激素信號調控途徑的基因。將非分蘗期(Stage0)和分蘗期(Stage1)樣本中的基因進行差異性表達分析后發(fā)現(xiàn)，在兩個種質之間及同一品種的不同組織部位之間存在巨大的差異性表達基因(D