賴型鉤端螺旋體毒力相關(guān)基因ompl17的蛋白質(zhì)功能學(xué)研究.pdf

1、鉤端螺旋體病(簡(jiǎn)稱鉤體病)是由鉤端螺旋體引起的一種人獸共患自然免疫源性疾病，它在世界范圍內(nèi)流行，并嚴(yán)重危害人類的健康和農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)。鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)在結(jié)構(gòu)和遺傳特征上都比較特殊，因而大多數(shù)細(xì)菌學(xué)研究方法不適于鉤體研究。隨著中國(guó)南方中心對(duì)賴型鉤體56601的測(cè)序完成，為鉤體病的研究提供了新的契機(jī)，但是與鉤體致病或毒力相關(guān)的因子研究報(bào)道還相對(duì)較少，致使鉤體致病的分子機(jī)制研究進(jìn)展緩慢。因此，闡明鉤端螺旋體的致病機(jī)制是控制本病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2、 本室曾以抑制消減雜交技術(shù)(Substration SlJppressiVeHybridization，SSH)篩選得到致病鉤體與非致病鉤體的差異基因片段，并采用盒式連接半巢式PCR技術(shù)擴(kuò)增出ompn7基因，進(jìn)行序列測(cè)定、生物信息學(xué)分析，同時(shí)采用基因打靶技術(shù)進(jìn)行了功能的初步分析和探討。本研究既往工作的基礎(chǔ)上，對(duì)賴型鉤體omp/17基因進(jìn)行擴(kuò)增表達(dá)，制備抗血清，分析該基因在賴型鉤體體內(nèi)外和不同溫度下表達(dá)情況，同時(shí)對(duì)該蛋白進(jìn)行表達(dá)純化

3、，采用構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜進(jìn)行血細(xì)胞的趨化分析，以及采用酵母雙雜交技術(shù)釣取ompn7基因在體內(nèi)相互作用的靶蛋白，為闡明鉤體分子致病機(jī)制作出新的探索。 本研究以SSH技術(shù)篩選并采用半巢式PCR擴(kuò)增獲得的賴型鉤體017株特異性外膜蛋白新基因Ompll7(GenBank，登錄號(hào)為AF534704)，提取賴型鉤體017株基因組，根據(jù)Ompll7 ORF閱讀框架設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲得Ompll7基因，進(jìn)行原核表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物免疫動(dòng)物獲得抗血清

4、，建立動(dòng)物模型分析該基因在體內(nèi)表達(dá)情況，以及該基因在不同溫度下的表達(dá)情況，分析提示可能與鉤體毒力有關(guān)。 為了研究鉤體017株外膜蛋白新基因omp/17與鉤體肺大出血的相關(guān)性，將Ompl17基因擴(kuò)增后在大腸桿菌JMl09中進(jìn)行融合表達(dá)，并將表達(dá)后產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后進(jìn)行酶切，得到純的omp/17基因表達(dá)產(chǎn)物。然后構(gòu)建血管內(nèi)皮基底膜，觀察該蛋白對(duì)血細(xì)胞的趨化作用，實(shí)驗(yàn)表明該蛋白對(duì)血細(xì)胞具有一定的趨化作用。 為了闡明鉤體致病

5、的分子機(jī)制，尋找鉤體致病的信號(hào)傳導(dǎo)通路，發(fā)現(xiàn)ompl17基因表達(dá)產(chǎn)物在體內(nèi)相互作用的靶蛋白。采用酵母雙雜交技術(shù)分別構(gòu)建誘餌質(zhì)粒載體和血管內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫(kù)，通過(guò)順序性轉(zhuǎn)染，并采用缺陷性培養(yǎng)基，獲得了12個(gè)克隆，將克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)行測(cè)序，然后將序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，尋找真正的陽(yáng)性克隆，并通過(guò)GenBank進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)有三種序列與相關(guān)蛋白有一定的同源性，但是還需要具體的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證。 本研究首次采用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行

6、問(wèn)號(hào)賴型鉤端螺旋體強(qiáng)毒株017外膜蛋白差異新基因omp/17的靶蛋白分析，同時(shí)采用重構(gòu)血管基底膜，分析該基因表達(dá)蛋白與賴型鉤體肺大出血的相關(guān)性，為進(jìn)一步證實(shí)其為毒力基因提供了證據(jù)。酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用則為致病鉤體毒力相關(guān)基因功能、分子免疫、遺傳進(jìn)化等發(fā)病機(jī)制研究提供了新的思路和技術(shù)手段。同時(shí)制備該基因表達(dá)產(chǎn)物的抗血清，分析該基因的免疫性和該基因在體外不同溫度下和動(dòng)物模型上的表達(dá)分布，進(jìn)一步闡明該基因可能為毒力相關(guān)基因，為鉤體新型疫苗的研