登革2型病毒樣顆粒在畢赤酵母中的表達(dá)和免疫學(xué)初步研究.pdf

1、研究背景：登革病毒(dengue virus，DENV)是單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科、黃病毒屬。DENV包含4個血清型：DENV-1，DENV-2，DENV-3和DENV-4。DENV的感染可引起一系列的臨床癥狀，包括登革熱(denguefever，DF)和登革出血熱(dengue hemorrhagic fever，DHF)/登革休克綜合征(dengue shock syndrome，DSS)。以蚊媒為主要傳播媒介的DENV廣泛

2、流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)。近20年來，隨著全球氣候變暖和全球化帶來的人口流動性增加，DENV的暴發(fā)和流行更為頻繁。中國的臺灣、海南、福建、廣東、廣西和浙江等沿海省份均為DENV的流行地區(qū)。廣州近幾年的登革疫情呈高發(fā)態(tài)勢。目前，世界上尚無可有效預(yù)防登革熱的疫苗和相應(yīng)的治療藥物。利用釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的HBsAg和HPV顆粒疫苗的成功上市提示開發(fā)安全高效的DENV的病毒樣顆粒(Virus-like particles.VLPs)疫苗具有廣闊

3、的應(yīng)用前景。以DENV為代表的黃病毒VLPs是指通過在體外表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)prM和E蛋白而組裝成的，具有與病毒粒子類似的空間結(jié)構(gòu)且不含病毒核酸的空心顆粒。由于VLPs保留了與天然病毒粒子類似的空間構(gòu)型和誘導(dǎo)中和抗體的抗原表位，因此VLPs不但能誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫，而且可以激發(fā)CD4+T細(xì)胞的增殖和CTL反應(yīng)(cytotoxic T lymphocyte)。VLPs被認(rèn)為是預(yù)防黃病毒感染的有效的、潛在的亞單位疫苗候選。
　　 目的：利用

4、含GAP(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)啟動子的畢赤酵母組成性表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)編碼DENV-2 prM和E蛋白的融合基因，在成功獲得DENV-2 VLPs的同時實(shí)現(xiàn)VLPs在該系統(tǒng)中的連續(xù)和高效表達(dá)。最后對VLPs的免疫原性和免疫保護(hù)性進(jìn)行研究，為開發(fā)四價的DENV病毒樣顆粒疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：首先，通過分子遺傳進(jìn)化分析選擇具有代表性的DENV-2流行株作為研發(fā)顆粒疫苗的候

5、選株；利用RT-PCR的方法從病毒上清中擴(kuò)增DENV-2的prM和E基因；設(shè)計并構(gòu)建含全長的E蛋白的prME與含截去E蛋白TM2跨膜域的prME472，分析TM2的缺失對E蛋白分泌水平和VLPs組裝的影響；利用在prM的N末端分別引入PrM信號肽和α信號肽以探索VLPs的高水平分泌表達(dá)。然后，將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定正確后，將重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母；將PCR鑒定正確的酵母克隆進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)；將發(fā)酵上清和細(xì)胞裂

6、解液分別進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting檢測；并分析目的蛋白的連續(xù)性表達(dá)情況；利用發(fā)酵上清進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)檢測VLPs的分泌情況；利用蔗糖梯度離心的方法從細(xì)胞裂解液中分離純化細(xì)胞內(nèi)的VLPs(Intracellular VLPs)，利用超濾濃縮的方法純化上清的VLPs(SecretedVLPs)。通過電子顯微鏡技術(shù)檢測VLPs的結(jié)構(gòu)以及在細(xì)胞內(nèi)的組裝特征。最后，將純化到的VLPs免疫BALB/c小鼠，通過ELISA測定

7、血清中特異性抗體的滴度；利用免疫熒光技術(shù)和體外中和試驗(yàn)檢測VLPs的免疫反應(yīng)性和中和抗體的滴度；對免疫鼠進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，評價VLPs能否誘導(dǎo)免疫記憶。
　　 結(jié)果：
　　 1.分子遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)室分離的DENV-2 ZS01/01株在進(jìn)化樹上與廣東省2001株的DENV-2流行株，以及菲律賓1998-2001年的DENV-2流行株比鄰，在基因分型上都屬于全球流行(Cosmopolitan)基因型。因此，選取D

8、ENV-2 ZS01/01株作為DENV-2病毒顆粒疫苗的候選株具有廣泛的代表性。
　　 2.本研究成功構(gòu)建了以下3種重組表達(dá)質(zhì)粒，包括：含prM信號肽和全長E蛋白的pGAPA-SprME；含prM信號肽和截去E蛋白TM2端的pGAPA-SprME472；含α信號肽和全長E蛋白的pGAPαA-prME；并將重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33，獲得了重組表達(dá)克隆。
　　 3.通過SDS-PAGE和Western blottin

9、g檢測發(fā)現(xiàn)E蛋白分別在含prM信號肽和α信號肽的引導(dǎo)下分泌到上清中。prM信號肽的分泌效率高于α信號肽。同時，與全長的E蛋白相比，缺失TM2端的E蛋白的分泌水平并不沒有得到明顯的提高。研究結(jié)果還表明含GAP啟動子的組成性表達(dá)系統(tǒng)能連續(xù)性和高效表達(dá)E蛋白。
　　 4.在含prM信號肽重組子的表達(dá)上清中檢測到了血凝活性。說明prM信號肽能有效的引導(dǎo)VLPs分泌到上清。且TM2端的缺失不會影響病毒顆粒的組裝。
　　 5.通過蔗

10、糖密度梯度離心，分離到了大小分別為30 nm和55 nm的DENVVLPs。并通過透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)這兩種VLPs在酵母細(xì)胞內(nèi)的組裝特征與DENV病毒感染細(xì)胞中類似。
　　 6.通過免疫電鏡觀察，在含prM信號肽的重組子的發(fā)酵上清濃縮液中檢測到了30 nm的VLPs，說明VLPs可以被prM信號肽有效的引導(dǎo)分泌到上清中。
　　 7.ELISA檢測抗體滴度表明VLPs能誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了高水平的的特異性抗體，最高滴度達(dá)到了

11、1:10000。免疫熒光結(jié)果表明將VLPs免疫血清稀釋1280倍后，仍在DENV-2感染的C6/36細(xì)胞漿內(nèi)檢測到了強(qiáng)烈的熒光信號。
　　 8.體外中和試驗(yàn)表明，VLPs免疫血清能有效的中和DENV-2 NGC株對C6/36細(xì)胞的感染，中和滴度與滅活的DENV-2免疫血清相同，均為1：45。攻毒后VLPs免疫鼠的中和抗體滴度有了很大的提升，達(dá)到了1：100。免疫結(jié)果提示VLPs能誘導(dǎo)BALB/c鼠產(chǎn)生免疫記憶反應(yīng)。
　　

12、 結(jié)論：
　　 1.DENV-2 ZS01/01株屬于全球流行基因型，可作為登革病毒樣顆粒疫苗的候選株。
　　 2.首次利用畢赤酵母非甲醇誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)成功的高水平表達(dá)了DENV-2VLPs。并在發(fā)酵上清中檢測到了VLPs的分泌，為VLPs后續(xù)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.首次在酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并分離到了兩種大小分別為30 nm和55 nm的DENV-2 VLPs。并利用透射電鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)DENV VLPs在酵母細(xì)