桑樹硬枝扦插生根的轉(zhuǎn)錄組分析及R2R3-MYB家族基因的綜合分析.pdf

1、本課題依托轉(zhuǎn)錄組二代高通量測序，結(jié)合相關(guān)生理實驗，對桑樹硬枝扦插繁育生根機理進(jìn)行了初步探討；同時，還深入研究并綜合分析了桑樹MYB（成髓細(xì)胞）功能基因家族。獲得的主要結(jié)果與結(jié)論如下：
　　1、根據(jù)插穗不同階段生理性狀的區(qū)別，分別選取3組基部皮層，定名為S0（陰性對照）、S1（根原基形成）和 S2（不定根伸長）。在穩(wěn)定數(shù)據(jù)后，得到總的有效讀長數(shù)為46,970,598~47,055,500條。在比對Uniprot蛋白庫后，獲得有效注釋

2、的基因數(shù)分別為18,729條，19,044條和19,987條，總的注釋比率為58.68％~60.53%。在組合重疊群數(shù)后，獲得相關(guān)差異基因，其中在S0 vs. S1中篩出327個，S1 vs. S2中篩出6,380個（FDR≤0.001,|log2Ratio|≥1)；并隨機選取了10個呈顯著差異表達(dá)的基因驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)果均符合預(yù)期。在系統(tǒng)處理上述差異表達(dá)基因后，利用生物本體（GO）和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）進(jìn)行生物信息學(xué)分

3、析，找出涉及桑樹扦插不定根形成的關(guān)鍵基因，信號通路和生命進(jìn)程等，綜合上述結(jié)果初步探討了桑樹扦插生根機理。
　　2、本課題對涉及不定根形成的桑樹MYB家族基因進(jìn)行了綜合分析。MYB家族基因作為典型的轉(zhuǎn)錄因子，其N-端存在幾個包含50~53個氨基酸不完全重復(fù)的保守結(jié)構(gòu)，分別被命名為R1，R2,R3。它們能形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)（HTH)與 DNA結(jié)合從而發(fā)揮相應(yīng)作用。利用 Pfam數(shù)據(jù)庫 MYB模型（DNA-binding doma

4、ins DBDs，PF00249)對桑樹基因組數(shù)據(jù)搜尋獲得相關(guān)基因，人工檢視保證存在保守的色氨酸（W)，包含不同重復(fù)結(jié)構(gòu)的MYB基因通過MEME程序（version4.8.1)進(jìn)行篩選和甄別，然后利用其構(gòu)建桑樹MYB家族基因的隱馬爾科夫模型（Hidden Markov Model)，通過進(jìn)一步比對，獲得桑樹中的MYB家族基因。根據(jù)重復(fù)結(jié)構(gòu)數(shù)目分類，最終獲得117個MYB相關(guān)型，123個R2R3-MYB型，4個3R-MYB型和3個非典型M

5、YB型。
　　3、在詳細(xì)研究了桑樹R2R3-MYB型基因后，克隆了其中3個涉及生根過程的典型基因，分別將它們定名為MmMYB1,MmMYB2,MmMYB3(基因庫登錄號：KT323919，KT323920，KT323921)，他們分別在硬枝扦插生根中發(fā)揮著不同方向的作用。MmMYB1功能同 AtMYB44（擬南芥），通過調(diào)節(jié) AHLs（N-acyl-homoserinelactones)通路從而影響革蘭氏陰性菌形成生長素和細(xì)胞分裂

6、素，進(jìn)而影響根的伸長；MmMYB2是一個類GmMYB39基因（大豆），它的抑制導(dǎo)致類黃酮合成受阻，從而可以提高根的生長；MmMYB3是一個赤霉素調(diào)控基因，通過對芽的發(fā)育調(diào)控從而影響了不定根的形成。在應(yīng)用生長素（IAA)和赤霉素（GA)溶液處理桑樹插穗后，熒光實時定量PCR檢測(內(nèi)參基因：MaACT1)結(jié)果顯示插穗基部皮層中隨機選取的R2R3-MYB基因在生長階段內(nèi)大部分表達(dá)量呈對應(yīng)的迅速上升與下降。對桑樹硬枝扦插不同時期的R2R3-MY