桑樹秋末冬初綠枝扦插生根的理化與轉(zhuǎn)錄組分析及鑒定.pdf

1、桑樹具有頑強的生命力和適應(yīng)性,生命期長,容易成林,不僅可綠化環(huán)境,防風(fēng)固沙,涵養(yǎng)水源,凈化空氣,收到良好的生態(tài)效應(yīng),還可以取得較高的經(jīng)濟(jì)效益。通過對桑樹扦插生理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究為桑苗快速繁育技術(shù)的創(chuàng)新提供理論支撐,加快優(yōu)良桑樹品種的推廣應(yīng)用,對提高桑園的質(zhì)量和產(chǎn)量具有重要的意義。
　　通過對秋末冬初桑樹綠枝扦插進(jìn)行相關(guān)生理生化指標(biāo)分析桑樹扦插生根的生理機理;利用Solexa高通量測序構(gòu)建了秋末冬初桑樹綠枝扦插生根過程中的4個轉(zhuǎn)錄

2、組數(shù)據(jù)庫,通過分析大量的測序結(jié)果,篩選出相當(dāng)多差異表達(dá)的基因,揭示了生根過程中轉(zhuǎn)錄組水平的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。并對在扦插生根過程中顯著差異表達(dá)的基因MaGH3.6的進(jìn)行基因的克隆、表達(dá)模式的分析、系統(tǒng)發(fā)生分析和功能驗證。
　　主要實驗結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1.可溶性糖和可溶性蛋白的含量在扦插生根過程總的趨勢是處于下降的趨勢,但在扦插后期,可溶性糖的含量逐步回升。在扦插前期,IAAO(吲哚乙酸氧化酶)的活性先顯著上升后下降,中期活

3、性變化不顯著,后期吲哚乙酸氧化酶活性逐漸上升并維持在較高活性水平。POD(過氧化物酶)呈現(xiàn)前期先逐步上升后下降,中期變化不大,后期先上升下降的趨勢。PPO(多酚氧化酶)的活性在整個扦插過程中,呈現(xiàn)“U”型變化。
　　2.通過Solexa高通量測序,構(gòu)建了4個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫:S1,S2,S3和S4。所得的原始序列經(jīng)過去除低質(zhì)量區(qū)域、denovo拼接,分別得到69058,69087,66557和66556個contig(序列片段)。對所

4、得contig與UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blastx比對,進(jìn)行蛋白功能注釋,4個數(shù)據(jù)庫分別有39504(57.20％),39497(57.17%),31868(57.17%)和23837(35.81%)有明確的蛋白功能注釋。為了解各個發(fā)育階段之間的差異基因表達(dá)情況,根據(jù)基因的表達(dá)量RPKM值對contig進(jìn)行篩選,共獲得332(S1vs.S2),6381(S2vs.S3)和842(S3vs.S4)個差異基因,并對獲得差異基因進(jìn)行GO

5、和KEGG功能富集。根據(jù)差異基因和GO和KEGG功能富集,詳細(xì)比較了每個發(fā)育階段之間的差異表達(dá)基因,結(jié)果表明:差異明顯的基因主要可分為:碳代謝和能量代謝,植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo),細(xì)胞分化、增值和細(xì)胞周期等3類。為驗證測序數(shù)據(jù)庫的有效性,隨機選取9個基因進(jìn)行qRT-PCR(熒光實時相對定量PCR)驗證,結(jié)果表明數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)與qRT-PCR結(jié)果基本一致,測序構(gòu)建的cDNA文庫數(shù)據(jù)準(zhǔn)確有效。
　　3.從桑樹莖部皮層克隆了一個桑樹GH3(gret

6、chen hagen3)基因,并將其命名為MaGH3.6(GenBank登錄號:KC349982)。生物信息學(xué)分析顯示該基因編碼611個氨基酸殘基,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為68.87kD,無跨膜區(qū)域和信號肽序列,而且蛋白質(zhì)序列相當(dāng)保守。半木質(zhì)化和木質(zhì)化的桑樹插穗經(jīng)NAA(萘乙酸)和IAA(吲哚-3-乙酸)誘導(dǎo)處理后,通過熒光實時定量PCR檢測到插穗皮層MaGH3.6的表達(dá)水平在0.5h內(nèi)急劇增加,并隨著時間延長呈逐漸增高趨勢,其中NAA誘導(dǎo)處理