基于轉(zhuǎn)錄組分析的絞股藍(lán)氧化鯊烯環(huán)化酶的挖掘與鑒定.pdf

1、絞股藍(lán)(Gynostemma pentaphyllun(Thunb.)Makino)屬于葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤本植物，其主要有效成分為絞股藍(lán)皂苷，在葉片中含量最高，目前分離鑒定的絞股藍(lán)皂苷已達(dá)160余種。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明絞股藍(lán)皂苷具有抗腫瘤、抗焦慮、抗動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)免疫力、降血糖、降血脂等多種藥理活性。絞股藍(lán)皂苷屬于三萜皂苷，因與人參皂苷具有相同或相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)而備受關(guān)注。氧化鯊烯環(huán)化酶(OSCs)是絞股藍(lán)皂苷三萜骨架結(jié)構(gòu)合成

2、的關(guān)鍵酶，本研究對(duì)絞股藍(lán)OSCs進(jìn)行了克隆和鑒定，為進(jìn)一步研究絞股藍(lán)皂苷的合成與調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。
　　植物信號(hào)分子茉莉酸甲酯(MeJA)可以誘導(dǎo)絞股藍(lán)皂苷上游合成途徑中的法尼基焦磷酸合酶(FPS)和鯊烯合酶(SS)基因上調(diào)表達(dá)，因此，我們推測(cè)參與絞股藍(lán)皂苷合成的OSCs基因也可能受MeJA調(diào)控。對(duì)MeJA處理0h，6h，12h，24h的絞股藍(lán)葉的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了Illumina測(cè)序，共獲取202，535，156條raw reads，采

3、用de novo組裝共獲得82，073條unigenes。通過(guò)基因注釋和分類，發(fā)現(xiàn)在GO分析中，有22，662個(gè)unigenes得到注釋，其中有45個(gè)基因參與次生代謝，有2，015個(gè)基因與代謝調(diào)節(jié)有關(guān)。在KEGG分析中，總共有291個(gè)基因與萜類代謝相關(guān)，其中有82個(gè)基因與萜類骨架合成相關(guān)，有42個(gè)基因與倍半萜和三萜的生物合成相關(guān)。
　　根據(jù)序列比對(duì)和注釋結(jié)果，篩選到5個(gè)絞股藍(lán)OSCs基因，分別為GpOSC1-5。序列分析發(fā)現(xiàn)在5個(gè)

4、OSCs中能找到OSCs的保守基序DCTAE，MWCHCR和QW。利用real-time PCR技術(shù)對(duì)OSCs進(jìn)行組織特異性和MeJA誘導(dǎo)表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)GpOSC1在絞股藍(lán)葉中高表達(dá)，其余4個(gè)基因在莖中表達(dá)量最高。MeJA對(duì)GpOSC1，4的表達(dá)具有抑制作用，GpOSC2，3，5的表達(dá)在MeJA處理的初期受到抑制，隨后表達(dá)量逐漸升高，在處理24小時(shí)后表達(dá)量達(dá)到最高。進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)GpOSC1屬于β-香樹(shù)脂合酶類;GpOSC2屬于環(huán)阿屯醇

5、合酶類，與已鑒定的西葫蘆(Cucurbita pepo)環(huán)阿屯醇合酶具有87.8％的相似性;GpOSC3屬于羊毛甾醇合酶類，與絲瓜(Luffa aegyptiaca)的羊毛甾醇合酶具有77.1％的相似性;GpOSC4屬于葫蘆二烯醇合酶類，與已鑒定的葫蘆二烯醇合酶的相似性均大于80％。GpOSC5屬于isomultiflorenol合酶類，與絲瓜(Luffa aegyptiaca)中isomultiflorenol合酶的相似性達(dá)到82.3

6、％。
　　將基因GpOSC1-5分別克隆到酵母表達(dá)載體pYES2中，并轉(zhuǎn)化釀酒酵母麥角甾醇缺陷型菌株GIL77。對(duì)外源基因誘導(dǎo)48小時(shí)后，離心收集菌體，堿法裂解細(xì)胞后用正己烷提取酶的催化產(chǎn)物，通過(guò)GC-MS分析，發(fā)現(xiàn)GpOSC1能夠合成兩個(gè)特異性產(chǎn)物（產(chǎn)物1和2），GpOSC4能夠合成一個(gè)特異性產(chǎn)物（產(chǎn)物3）。通過(guò)比較保留時(shí)間和質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)這三個(gè)產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)瑪烯二醇Ⅱ、羽扇豆醇、葫蘆二烯醇、樺木醇和β-香樹(shù)脂等具有顯著差異。通過(guò)