宿主凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白在羊口瘡病毒致炎中的作用研究.pdf

1、羊口瘡，又稱羊傳染性膿皰皮炎，是由羊口瘡病毒（Orf virus，ORFV）引起的人獸共患傳染病，主要發(fā)生于綿羊、山羊、多種野生動(dòng)物和人。特征性病變是在唇、口、鼻等部位出現(xiàn)紅斑、丘疹、膿皰和痂皮。羊口瘡病毒在世界范圍內(nèi)廣泛分布，凡是養(yǎng)羊地區(qū)均有該病的發(fā)生和流行。中國除傳統(tǒng)的養(yǎng)羊區(qū)如東北、西北地區(qū)均有該病的發(fā)生和流行外，山東、廣東、云南等地也出現(xiàn)該病的發(fā)生和流行。雖然羊口瘡病毒對(duì)人危害性不大，但是由于其高感染率和分布廣泛，給畜牧業(yè)造成巨大

2、的經(jīng)濟(jì)損失。ORFV自身能夠產(chǎn)生抗炎蛋白來逃避宿主免疫反應(yīng)，引起宿主重復(fù)發(fā)病。由于缺乏有效的防控措施以及對(duì) ORFV介導(dǎo)宿主免疫和致病機(jī)制了解不足，該病在羊群中頻繁暴發(fā)流行。凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白是炎癥小體重要接頭蛋白，在炎癥小體介導(dǎo)的抵抗病原微生物感染中具有重要作用。目前，還沒有關(guān)于凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白在ORFV感染中的作用研究，這嚴(yán)重妨礙了ORFV介導(dǎo)宿主免疫和致病機(jī)制的深入研究。因此，本文進(jìn)行了如下研究：
　　1、羊口瘡病毒廣東增

3、城株的分離與鑒定
　　利用OFTu細(xì)胞從廣東增城某疑似發(fā)病黑山羊痂皮組織中分離羊口瘡病毒，通過觀察細(xì)胞病變形態(tài)、測(cè)定病毒滴度和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等方法對(duì)分離的毒株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，病料接種于OFTu細(xì)胞后盲傳至第四代出現(xiàn)典型病變；測(cè)得第五代病毒滴度為108.65TCID50/mL；擴(kuò)增出羊口瘡病毒特異性基因ORFV011、ORFV059、ORFV109、ORFV110和ORFV127；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明分離的羊口瘡病毒與羊口

4、瘡病毒FJ-DS和FJ-GT親緣關(guān)系較近。以上結(jié)果說明成功分離到羊口瘡病毒，將其命名為ORFV-GDZC株。
　　2、海南黑山羊ASC基因克隆及序列分析
　　運(yùn)用RT-PCR方法擴(kuò)增了海南黑山羊ASC基因，并將其克隆到pMD18-T載體中進(jìn)行測(cè)序，對(duì)獲得的基因序列提交到GenBank，獲得accession no：KM576770。運(yùn)用分子生物學(xué)軟件對(duì)所獲得的序列進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，所克隆的海南黑山羊 ASC基因編碼196

5、個(gè)氨基酸，蛋白分子量約為22.1 kDa。通過DNASTAR軟件對(duì)不同物種的ASC基因序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，海南黑山羊ASC基因與牛、人、豬、獼猴、小鼠、大鼠、非洲爪蟾和斑馬魚的同源性分別為95.2％、81.3%、83.0%、79.8%、75.4%、75.1%、49.2%、43.7%，該基因在哺乳類動(dòng)物間的同源性高，和兩棲類動(dòng)物間的同源性低，僅有50%。
　　3、海南黑山羊ASC的原核表達(dá)與多抗制備
　　通過雙酶切

6、和序列測(cè)定證明成功構(gòu)建了pET32a(+)-ASC表達(dá)質(zhì)粒。ASC-His標(biāo)簽重組融合蛋白得到有效表達(dá)，通過SDS蛋白凝膠電泳檢測(cè)純化蛋白條帶大小約為40 kDa，與其預(yù)測(cè)的大小相一致。用His標(biāo)簽抗體和免疫家兔制備的純化IgG抗體分別進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果表明表達(dá)的融合蛋白均為ASC-His標(biāo)簽重組融合蛋白。
　　4、ASC真核過表達(dá)載體和RNAi干擾載體構(gòu)建
　　以克隆質(zhì)粒pMD18-T-C-ASC為模板

7、，設(shè)計(jì)特異性引物，構(gòu)建pIRES2-EGFP-ASC真核過表達(dá)質(zhì)粒。將pIRES2-EGFP-ASC轉(zhuǎn)染OFTu細(xì)胞，經(jīng)熒光顯微觀察和IFA檢測(cè)，可觀察到非常強(qiáng)的綠色熒光，表明過表達(dá)載體構(gòu)建成功。利用生物學(xué)軟件，設(shè)計(jì)ASC基因的寡核苷酸引物，構(gòu)建了pSuper-shASC干擾載體。通過shRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)ASC在OFTu細(xì)胞內(nèi)的沉默表達(dá)，熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染shRNA-ASC24h內(nèi)ASC mRNA表達(dá)抑制效率達(dá)60%。

8、
　　5、ASC在ORFV感染宿主細(xì)胞致炎中的作用研究
　　首先，利用熒光定量PCR方法對(duì)ORFV感染不同時(shí)間段（1、2、3、4、6、12、24h）OFTu細(xì)胞中 ASC基因以及宿主細(xì)胞炎性因子的表達(dá)變化規(guī)律進(jìn)行分析。結(jié)果表明，ASC基因及宿主細(xì)胞炎性因子在病毒感染早期表達(dá)量上調(diào)，在感染后2h mRNA表達(dá)量最高，激活了宿主炎癥免疫反應(yīng)。為進(jìn)一步分析ASC在ORFV感染過程中的功能，本研究將ORFV分別感染ASC過表達(dá)及抑制