非洲豬瘟病毒VP72基因表達(dá)與ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、非洲豬瘟(ASF)是由ASFV引起的豬的急性、烈性傳染病，以全身出血、呼吸障礙和神經(jīng)癥狀為主要特征，強(qiáng)毒株感染的發(fā)病率和死亡率可達(dá)100％，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害巨大，是各國(guó)嚴(yán)密防范的傳染病，也是世界豬病研究的重點(diǎn)。目前我國(guó)尚無(wú)本病的發(fā)生。但隨著國(guó)際貿(mào)易和人員交往的日益頻繁，該病傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)是存在的，因此建立快速診斷方法十分必要。 為了建立ASFV特異抗體檢測(cè)方法，本研究根據(jù)國(guó)外發(fā)表的ASFVVP72基因序列設(shè)計(jì)引物，以英國(guó)動(dòng)物健康研究

2、所提供的含VP72基因的質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增VP72基因及其可溶性抗原片斷VP72S，將其插入pUC載體中進(jìn)行測(cè)序，所獲序列與已發(fā)表的ASFV-VP72(Ba71株)完全相同。將測(cè)序正確的VP72和VP72S基因克隆入pGEX-6p-1載體中GST基因的下游，重組大腸桿菌用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并采用不同方法純化得GST融合蛋白。將VP72基因克隆入真核表達(dá)pcDNA3中，重組載體用多聚乙酸亞胺包裹后基因免疫8周齡小鼠，用制備的血清對(duì)原核表達(dá)產(chǎn)

3、物進(jìn)行Western-blotting驗(yàn)證，結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)原核表達(dá)的重組VP72是正確的，具有抗原性，可以作為檢測(cè)ASF特異抗體的抗原，并為特異單抗制備提供了免疫原。以表達(dá)的融合蛋白為包被抗原，以基因免疫鼠血清為陽(yáng)性抗體，建立了檢測(cè)ASFV抗體的ELISA方法，可用于ASFV血清學(xué)診斷和流行病學(xué)調(diào)查。 根據(jù)已發(fā)表的ASF-VP72基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物，從含有VP72基因的質(zhì)粒中擴(kuò)增出VP72基因和VP72主要抗原片斷VP7

4、2S基因，鑒定正確后分別克隆入原核表達(dá)載體pGEX-6p-1和真核表達(dá)載體peDNA3中，將鑒定正確的pGEX-VP72(S)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，純化獲得表達(dá)產(chǎn)物。將pcDNA-VP72多次基因免疫小鼠，制備抗血清，并對(duì)原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western-blotting驗(yàn)證。結(jié)果表明，大腸桿菌表達(dá)的VP72和VP72S的分子量與預(yù)期的相符，能被基因免疫的抗血清識(shí)別，為檢測(cè)ASFV特異抗體的ELISA試劑盒