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文檔簡介
1、研究背景:缺血性心肌病主要表現(xiàn)為心肌缺血或心肌梗死,隨著人民生活水平的提高及社會競爭壓力的增大,其發(fā)病率逐年上升并呈低齡化趨勢。如何找到一種能夠降低死亡率,改善心肌缺血及提高心肌梗死后心功能的治療方法成為國內外研究的熱點。近年來國內外研究報道,電針(EA)治療缺血性心肌病有其獨特的療效,而下丘腦(Hypothalamus)及延髓頭端腹外側區(qū)(rostral ventrolateralmedulla, RVLM)作為心血管調控的中樞部位可
2、能參與其中,但其機制仍不是很清楚。1998年研究學者發(fā)現(xiàn)一種新的下丘腦神經肽—orexin,已報道其參與進食行為、能量平衡及睡眠-覺醒的調節(jié),我們對其心血管調節(jié)特別有興趣。近年研究證實,中樞活性氧(reactive oxygen species,ROS)參與交感興奮所致的心血管效應。那么,中樞orexin是否參與了電針改善心肌缺血,而其調節(jié)作用是否與下丘腦和RVLM有關,中樞活性氧是不是介導了orexin對心肌缺血的調節(jié)作用,目前這些機
3、制仍不是很清楚。
目的:本課題通過建立急性心肌缺血(AMI)大鼠模型,觀察電針內關穴對急性心肌缺血的改善作用,檢測AMI組和AMI+EA大鼠心血管調節(jié)下丘腦外側區(qū)的OXA及RVLM的OX1R的表達,并觀察OXA阻斷劑、ROS的清除劑及NADPH氧化酶的抑制劑在RVLM對OXA引起心血管效應的影響,同時檢測RVLM氨基酸的釋放改變,從而研究OXA調節(jié)中樞交感傳出的主要中樞部位,以及與其他心血管調節(jié)中樞遞質和調質的關系,以分析or
4、exin調節(jié)心血管活動的作用途徑,進一步探討電針改善心肌缺血的中樞機制。
方法:AMI大鼠模型采用結扎冠狀動脈左前降支制備;大鼠針刺穴位選擇雙側“內關”穴,針刺對照穴位選擇雙側“列缺”穴;并監(jiān)測大鼠心率(HR),平均動脈壓(MAP),心室內壓(IVP),觀察AMI大鼠及其針刺后心功能各項指標的變化。采用氯化四唑(TTC)染色檢測梗死心肌面積、蘇木精和伊紅(HE)染色觀察梗死心肌組織形態(tài)以及超聲心動圖觀察心臟的室壁結構。采用心率
5、變異性(HRV)分析系統(tǒng)記錄大鼠心臟自主神經功能狀態(tài),并通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定各組大鼠血漿去甲腎上腺素(NE)和腎上腺素(E)的含量。采用免疫組織化學(IHC)方法檢測各組(對照組、AMI組、AMI+EA內關組)大鼠下丘腦外側區(qū)OXA和RVLM區(qū)OX1R的表達;采用蛋白免疫印跡法(western blot)檢測各組(對照組、AMI組、AMI+EA內關組)RVLM區(qū)OX1R蛋白的表達變化;采用熒光定量聚合酶鏈式反應(Re
6、altime-PCR)觀察各組大鼠下丘腦prepro-orexin(PPO)的mRNA表達變化;采用化學發(fā)光法測定各組大鼠RVLM區(qū)ROS的含量變化;采用激光共聚焦結合免疫熒光雙標技術觀察RVLM區(qū)OX1R與NADPH氧化酶亞單位p47phox及gp91phox的共表達;采用中樞核團RVLM微量注射的方法觀察OXA對心功能指標的影響,及其阻斷劑SB-408124、ROS的清除劑Tempol及NADPH氧化酶的抑制劑Apocynin對OX
7、A心血管效應的影響;采用微透析結合高效液相色譜熒光檢測技術(HPLC-FD),觀察各組大鼠RVLM區(qū)氨基酸遞質釋放的改變。
結果:
(1) AMI模型制備:冠狀動脈左前降支結扎后,大鼠立即出現(xiàn)心電圖S-T段抬高,結扎線遠端心肌發(fā)白,運動減弱,說明AMI模型制備成功。TTC及HE染色顯示AMI后梗死心肌組織及EA后的改善狀況,超聲心動圖顯示AMI后左室內徑增大室壁厚度變薄。
(2)心功能指標監(jiān)測:冠脈結扎5天
8、后,AMI大鼠心率(HR)加快,左室舒張末期壓力(LVEDP)升高,其他各項心功能指標,包括左室收縮末期壓(LVSP)、左室壓力最大上升速率(+dp/dtmax)、左室壓力最大下降速率(-dp/dtmax)均顯著降低(P<0.01,n=6)。電針AMI大鼠雙側“內關”穴后,其HR與LVEDP下降,其他各項心功能指標也均有明顯改善(P<0.01,n=6)。而電針AMI大鼠雙側“列缺”穴與電針“內關”穴相比其心功能沒有得到改善(P<0.05
9、或P<0.01,n=6)。
(3)心率變異性(HRV)監(jiān)測及血清腎上腺素(E)與去甲腎上腺素(NE)含量測定:AMI大鼠HRV分析顯示,其LF/HF明顯升高,EA“內關”后可降低LF/HF比值(P<0.05,n=6); AMI大鼠血清中NE與E明顯增多(P<0.05,n=6),EA后兩者含量明顯降低。
(4)免疫組織化學(IHC)結果顯示,AMI大鼠HPO的OXA陽性神經元與RVLM的OX1R陽性神經元與對照組相比明
10、顯增多,包括相對光密度值及神經元個數(shù)(P<0.05,n=6),EA“內關”穴后兩部位的陽性神經元明顯減少(P<0.05,n=6),而EA“列缺”穴后兩部位陽性神經元與AMI組相比無明顯變化。
(5) western blot結果顯示,OX1R蛋白在各組大鼠RVLM均有表達;與對照組相比,AMI組大鼠RVLM的OX1R蛋白表達明顯增多(P<0.01,n=4),EA后OX1R蛋白的表達可降低。
(6) real-time
11、 PCR結果顯示,各組大鼠下丘腦均有OXA表達;AMI組大鼠下丘腦的PPO mRNA與對照組相比明顯增多(P<0.01,n=7),EA后可使其減少(P<0.05,n=7)。
(7)激光共聚焦結合免疫熒光雙標結果顯示,RVLM區(qū)OX1R與NADPH氧化酶的胞膜亞單位gp91 phox及胞漿亞單位p47phox存在共表達
(8)化學發(fā)光法測定ROS結果顯示,AMI大鼠RVLM區(qū)ROS含量與對照組相比顯著升高(P<0.05
12、,n=7),EA后可降低ROS的含量(P<0.05,n=7)。AMI大鼠側腦室注射OXA(100pmol)后RVLM區(qū)ROS產生增多(P<0.05,n=4),注射SB(100pmol)、Tempol(50nmol)或Apo(5nmol)可阻斷這種效應(P<0.05或,n=4)。
(9)各組(對照組、AMI組、AMI+EA內關組)大鼠RVLM微量注射OXA及阻斷劑SB后心功能變化顯示,OXA(100pmol)能使各組大鼠各心功能
13、指標(HR、MAP、+dp/dtmax及-dp/dtmax)明顯升高,并且升高幅度在AMI大鼠更明顯。RVLM注射OXA抑制劑SB(100pmol)、Tempol(50nmol)或Apo(5nmol)能夠阻斷OXA引起的心血管效應(P<0.05或P<0.01,n=7)。
(10)微透析結合HPLC結果顯示,AMI大鼠單側RVLM微量注射OXA(100pmol),注射后第一、第二及第三個10minRVLM透析液中氨基酸含量與注射
14、前10min內的相比,EAA谷氨酸(Glu)釋放增多(P<0.05,n=6),IAA甘氨酸(Gly)和?;撬?Tau)釋放減少;預先注射Tempol(50nmol)、Apo(5nmol)后再注射OXA,與單獨注射OXA相比,Glu釋放明顯減少(三者P<0.05,n=6),Gly與Tau稍有增加。
結論:結扎大鼠冠脈左前降支可以成功制備AMI大鼠模型,其心功能明顯下降,繼發(fā)交感活性增強;電針內關穴可以增強AMI大鼠的心功能,降低
15、繼發(fā)的交感活性增強。這可能與中樞部位下丘腦外側區(qū)的OXA及RVLM的OX1R表達上調有關,并且AMI大鼠RVLM的活性氧釋放增多,NADPH氧化酶與OX1R在RVLM存在共表達,外源性OXA的心血管效應可以被Tempol和APO阻斷,同時觀察到OXA可引起AMI大鼠RVLM區(qū)EAA-Glu增多,IAA-Gly/Tau減少,而Tempol及Apo可阻斷這一效應。這都提示了針刺改善心肌缺血的機制之一是通過下調中樞OXA及OX1R,進而降低N
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