PR1-HLA-A-0201單鏈三聚體慢病毒載體的構(gòu)建及初步研究.pdf

1、慢病毒載體(Lentiviral vector)是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒(HIV-1)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因載體。慢病毒載體和一般逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的明顯區(qū)別是對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，能有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞。該載體能夠通過整合宿主DNA的方式使目的基因長(zhǎng)期而穩(wěn)定的表達(dá)。此外，慢病毒載體還具有攜帶外源基因片段較大，免疫原性小，安全性高等優(yōu)點(diǎn)，為細(xì)胞水平和整體水平的轉(zhuǎn)基因研究提供了

2、更強(qiáng)有力的工具。
　　 細(xì)胞免疫在腫瘤免疫中起主要作用。CD8+T淋巴細(xì)胞識(shí)別腫瘤抗原受人類白細(xì)胞抗原Ⅰ類分子(HLA-Ⅰ)的限制。特異性CD8+T淋巴細(xì)胞的活化必須首先利用T細(xì)胞抗原受體識(shí)別抗原遞呈細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的HLA-Ⅰ類分子遞呈的抗原肽，獲得活化的第一信號(hào)，然后通過共刺激分子受體和配體的結(jié)合獲得第二信號(hào)。腫瘤過繼免疫治療通常采用自體抗原提呈細(xì)胞活化T細(xì)胞，限制了其在臨床的運(yùn)用。而人工抗原提呈細(xì)胞(artifici

3、al antigen presenting cell，aAPC)具有易培養(yǎng)、活化條件易控制、T細(xì)胞活化增殖周期短等優(yōu)點(diǎn)，故近年來對(duì)人工抗原提呈細(xì)胞的研究日趨活躍。
　　 我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)室原有工作的基礎(chǔ)上，設(shè)想構(gòu)建一個(gè)單鏈三聚體(sinvie chaintrimer，SCT)重組融合基因，將MHCⅠ分子、β2m和抗原肽的基因片段以適當(dāng)?shù)慕宇^(linker)串聯(lián)在一起，然后將其克隆進(jìn)慢病毒載體。利用慢病毒載體將該新型的SCT基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)

4、染本實(shí)驗(yàn)室制備的人工抗原遞呈細(xì)胞(artificial antigen-presentingcells，aAPC)K562/4-1BBL/CD86細(xì)胞株，使其成為一個(gè)既能向抗原特異性CD8+T細(xì)胞提供共刺激信號(hào)(即第二信號(hào))，又能通過MHC分子同時(shí)向CD8+細(xì)胞提供特異性抗原肽的信號(hào)(即第一信號(hào))的人工抗原遞呈細(xì)胞。
　　 在本研究中，我們選用的MHC-Ⅰ類分子為HLA-A*0201，抗原表位為PR1(VLQELNVTV)。PR

5、1是人類髓系白血病的腫瘤相關(guān)抗原蛋白酶3中的一條HLA-A*0201限制性的、強(qiáng)免疫原性多肽，其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有顯著抗髓系白血病作用。我們首先利用基因工程技術(shù)將PR1肽、β2m及HLA-A*0201以(G4S)n柔性linker依次串聯(lián)，構(gòu)建PR1-HLA-A*0201-SCT融合基因，再克隆至慢病毒載體系統(tǒng)表達(dá)質(zhì)粒中，測(cè)序正確后將HIV-1來源的慢病毒載體系統(tǒng)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞。收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清，得到具有一次感染能力而無復(fù)