InsB15-23H-2Kd單鏈三聚體在NOD小鼠體內(nèi)誘生特異性CD8+T細胞的實驗研究.pdf

1、Ⅰ型糖尿病(type1diabetes，T1D)是一種器官特異性自身免疫性疾病，其發(fā)病機制復(fù)雜，但最終結(jié)果都是由于T細胞浸潤胰島，導(dǎo)致胰島β細胞和其他一些相關(guān)細胞破壞，造成體內(nèi)胰島素缺乏和糖代謝失調(diào)。抗原特異性CD8+T淋巴細胞可以識別胰島β細胞表面由MHC-Ⅰ類分子遞呈的自身抗原肽，通過分泌穿孔素和顆粒酶等機制發(fā)揮細胞毒作用，從而破壞胰島β細胞。因此對疾病期間出現(xiàn)的針對一些自身反應(yīng)性抗原的T細胞的檢測意義重大。在已發(fā)現(xiàn)的一些自身反應(yīng)性

2、抗原中Insulin抗原尤其是InsulinB15-23肽被認為是T1D的觸發(fā)抗原，但是其作用的具體機制尚未闡明。所以，對Insulin特異性CD8+T淋巴細胞監(jiān)測尤為重要。
　　 MHCⅠtetramer技術(shù)是被公認的定量檢測CD8+T淋巴細胞的工具。由于傳統(tǒng)MHCⅠ四聚體制備流程繁瑣，而且低親和力的InsulinB15-23抗原肽很難與MHCⅠ重鏈和輕鏈分子形成穩(wěn)定的MHCⅠ單體，因此我們試圖引入MHC-Ⅰ單鏈三聚體技術(shù)(s

3、inglechaintrimer，SCT)，制備InsB15-23H-2Kd單鏈三聚體。將InsB15-23抗原肽，輕鏈β2m和MHCⅠ類分子重鏈用兩個柔性接頭(linker)依次連接成一個整體，提高抗原肽與H-2Kd分子的穩(wěn)定性。同時，為增強抗原肽InsB15-23與抗原結(jié)合槽的錨合能力，并增加膜表達SCT的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，我們在link1與H-2Kd近抗原端引入“二硫鍵”，將SCT分子中重鏈“肽C末端結(jié)合區(qū)”的84位酪氨酸突變成半胱氨酸

4、(Y84C)，同時在linker1中引入一個半胱氨酸(L2C)，使兩個半胱氨酸殘基間形成一個二硫鍵，幫助抗原肽更好地與抗原結(jié)合槽結(jié)合，即dtSCT(disulfide-trap)。基于上述原因，我們實驗室已經(jīng)成功制備可溶性InsB15-23H-2Kd-dtSCT單體(以下簡稱sSCT)，用于制備一種新型的四聚體，作為CD8+T淋巴細胞定量檢測的工具。
　　 在sSCT單體的基礎(chǔ)上，我們試圖構(gòu)建能夠膜表達的InsB15-23H-2

5、Kd全長SCT融合基因真核表達載體，觀察其體內(nèi)誘生InsB15-23特異性CTL細胞的能力，從而鑒定sSCT是否有正確的立體構(gòu)象。而為了提高CD8分子與H-2Kd的親和力，進一步增強膜表達InsB15-23H-2Kd-SCT向特異性T細胞遞呈抗原的能力，我們引入了Q115E的突變，構(gòu)建得到一個真核表達質(zhì)粒pInsB15-23H-2KdQ115Efl-dtSCT(以下簡稱mSCT)。用上述質(zhì)粒免疫四周齡NOD小鼠，分別免疫一次和三次后，流

6、式檢測小鼠外周血以及脾臟細胞中CD8、InsB15-23雙陽性T細胞的數(shù)量。實驗發(fā)現(xiàn)免疫三次后NOD小鼠的外周血CD8、InsB15-23抗原肽雙陽性T細胞達到5.34％，高于空質(zhì)粒組和空白對照組免疫NOD小鼠(1.04％和0.69％)，免疫三次檢測到的特異性CTL頻率明顯高于免疫一次。同時未能在脾臟中誘導(dǎo)出特異性的CTLs，而這群特異性細胞的靶組織胰島中檢測的結(jié)果也僅有1.3％，具體機制還需進一步探討。
　　 實驗結(jié)果表明在N

7、OD小鼠體內(nèi)表達的sSCT分子具有正確的立體構(gòu)像，能夠在NOD小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)InsB15-23特異性CTL細胞。我們成功構(gòu)建了有功能的InsB15-23H-2Kd-dtSCT融合基因，為制備新型H-2Kd-SCT四聚體作為CD8+T淋巴細胞定量檢測工具，同時為選擇性清除糖尿病模型NOD小鼠體內(nèi)自身反應(yīng)性InsB15-23特異性CTL細胞的實驗工作奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，并積累了相關(guān)研究資料。同時也為其他自身反應(yīng)性疾病的研究帶來一些方法學(xué)上的啟示。