影響rTNFα三聚體形成的關(guān)鍵微觀結(jié)構(gòu)的研究.pdf

1、人腫瘤壞死因子a(TNFa)的是由受刺激的單核-巨噬細(xì)胞所分泌的一種非糖基化蛋白質(zhì)，以三聚體形式發(fā)揮多種生物學(xué)活性，主要參與炎癥反應(yīng)并能引起腫瘤組織壞死，因此有著廣泛的臨床應(yīng)用前景。由于腫瘤壞死因子突變體的臨床治療劑量和毒性劑量十分接近，臨床應(yīng)用時(shí)毒副作用較大，需要通過基因工程手段對腫瘤壞死因子進(jìn)行改造。到目前為止，利用基因工程的辦法已得到許多TNFa的改構(gòu)體。但是在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌中TNFa改構(gòu)體的可溶性表達(dá)產(chǎn)物是單體和三聚體

2、的混合物，而體外活性實(shí)驗(yàn)早就證明TNFa的單體沒有生物活性。
　　 質(zhì)譜的數(shù)據(jù)表明，單體的TNFa和形成三聚體的TNFa在分子量上沒有任何區(qū)別。一般而言，在大腸桿菌中得到的可溶蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物，應(yīng)該擁有正確的立體結(jié)構(gòu)，但是顯然在TNFa的場合不成立。綜合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，大腸桿菌表達(dá)的TNFa產(chǎn)物中出現(xiàn)的單體乃是蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊所造成。本博士論文的焦點(diǎn)就是要查明單體TNFa到底在什么地方發(fā)生了錯(cuò)誤折疊。
　　 在本博士論文所用

3、的TNFa改構(gòu)體中有9個(gè)脯氨酸(Pro)，因此在Pro上可能發(fā)生順反式的變化而導(dǎo)致TNFa的錯(cuò)誤折疊。在第一章的工作中，首先探討了是否可以用脯氨酸異構(gòu)酶PPIase(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase)來提高大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物中三聚體的比例。選用RotA和FkpA這兩種PPIase的基因與TNFa改構(gòu)體在大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)，純化得到的TNFa改構(gòu)體在FPLC分子篩層析上分析單體和三聚體的比例，結(jié)果表面

4、PPIase的共表達(dá)可以明顯提高產(chǎn)物中的三聚體的比率，其中FkpA的作用最顯著，幫助提高近4倍的三聚體TNFa。放置一個(gè)月的三聚體經(jīng)過FPLC分離沒有出現(xiàn)單體，說明TNFa的三聚體是穩(wěn)定、均一的存在，處于蛋白質(zhì)折疊過程的終點(diǎn)。TNFa的單體放置一段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)微量的三聚體，但是這個(gè)比率在放置一周后和放置一個(gè)月后并無明顯的變化，這說明這部分新形成的三聚體并非來自有錯(cuò)誤折疊的單體自發(fā)發(fā)生正確折疊，而是來自原本就有正確折疊的沒來得及形成三聚體

5、的單體。將單體用8 M尿素進(jìn)行變性后透析復(fù)性，并沒有觀察到新的三聚體的形成，也證明單體的TNFa是無法自發(fā)獲得正確的折疊的。
　　 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道TNFa的C末端是形成三聚體的主要區(qū)域。NMR是一種常用的研究生物分子的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的技術(shù)，可以通過比對氨基酸的質(zhì)子峰來判斷肽鏈中Pro殘基的順反異構(gòu)情況，本博士論文選擇NMR作為手段來研究單體TNFa中發(fā)生的結(jié)構(gòu)上的變化。在第二部分的工作中，將分離純化到的TNFa三聚體和單體分別用NTCB(

6、2-nitro-5-thiocyanatoben)，IBA(2-iodosobenzoic acid)和胰蛋白酶逐步水解成含有1-2個(gè)脯氨酸位點(diǎn)的小肽。利用HPLC分離純化，并用MALDI-TOF-MS/MS進(jìn)行鑒定，得到了TNFa的C端70-120位氨基酸的水解產(chǎn)物各10 mg：k1肽段(三聚體的第71-84氨基酸，含一個(gè)Pro)、k1’肽段(單體的第71-84位氨基酸)、k3肽段(三聚體的第91-100位氨基酸，含一個(gè)Pro)、k3

7、’肽段(單體的第91-100位氨基酸)、T4肽段(三聚體的第101-114位氨基酸，含2個(gè)Pro)和T4’肽段(單體的第101-114氨基酸)。
　　 在第三部分工作中，通過NMR技術(shù)解析了第二部分工作所得到的肽段在溶液中的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)。通過對比k1、k1’以及k3、k3’的一維質(zhì)子NMR譜，沒有發(fā)現(xiàn)化學(xué)位移的明顯變化，說明這兩段肽段中的Pro的構(gòu)象一致。但T4和T4’的一維質(zhì)子NMR譜卻有了較大的化學(xué)位移，說明TNFa的第101-

8、114位氨基酸所處的微環(huán)境有極大不同。但是，對比T4、T4’的二維NMR譜圖發(fā)現(xiàn)第106位和第114位的兩個(gè)Pro并沒有發(fā)生順反異構(gòu)的變化，均為反式構(gòu)象。反而是第114位色氨酸(Trp)側(cè)鏈的構(gòu)象有了明顯不同。為了驗(yàn)證NMR的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并說明Trp側(cè)鏈的構(gòu)象變化會(huì)對三聚體的形成帶來的影響，我們以TNFa的X-晶體衍射數(shù)據(jù)(單體樣本PDB編號(hào)：4TSV；三聚體樣本PDB編號(hào)：5TSW)為基礎(chǔ)構(gòu)建了TNFa的三維結(jié)構(gòu)模型。通過模型分析可以確定

9、，TNFa的單體和三聚體中的Pro沒有順反異構(gòu)的變化，但第114位Trp在單體和三聚體中發(fā)生了較大構(gòu)象變化，表現(xiàn)為Trp的芳香環(huán)與第106位Pro的芳香環(huán)之間距離的在單體中為2.21nm，而在三聚體中為0.62nm。這種構(gòu)象變化使得第101-114位氨基酸之間的側(cè)鏈形成的U型轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)在單體中為親水空腔，而在三聚體中卻為疏水空腔。三聚體的三個(gè)亞基正是通過這段疏水空腔聚集在一起，形成一個(gè)疏水的等邊三角形結(jié)構(gòu)，這正是三聚體穩(wěn)定存在的作用力。<