1-磷酸鞘氨醇保護(hù)無血清狀態(tài)下內(nèi)皮祖細(xì)胞的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、背景： 成人內(nèi)皮細(xì)胞屬分化成熟的細(xì)胞，增殖能力不強(qiáng)。在組織受損、缺血性疾病和全身炎癥反應(yīng)綜合征、多器官功能障礙等病程中，有大量血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損害，這些部位修復(fù)(再內(nèi)皮化或血管生成)難以僅僅通過周邊的內(nèi)皮細(xì)胞增生、爬行來實(shí)現(xiàn)。大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在機(jī)體內(nèi)具有修復(fù)受損血管內(nèi)皮和生成新血管的功能。當(dāng)前，EPCs的分離、培養(yǎng)、鑒定，體內(nèi)分布、來源、分化、遷徙、歸巢

2、、功能及應(yīng)用等方面正被廣泛而深入地研究。本研究第一部分，對從大鼠骨髓中分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增出EPCs及細(xì)胞鑒定進(jìn)行探討。 后天血管生成能力與到達(dá)修復(fù)局部的EPCs的功能和數(shù)量密切相關(guān)。在缺血性疾病中，增加缺血部位的EPCs的數(shù)量，可獲得良好的治療效果。由于EPCs的修復(fù)作用常需要在缺血的環(huán)境下完成。因此，如何保護(hù)EPC s在不利的內(nèi)外環(huán)境中的生存能力，對改善患者預(yù)后具有重大意義，也成為目前研究熱點(diǎn)。本研究采用無血清培養(yǎng)法(用去除血清

3、及細(xì)胞生長因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞)干預(yù)EPCs，觀察在無血清無細(xì)胞因子狀態(tài)對EPCs的影響，并用1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phosphate，SlP)干預(yù)這種狀態(tài)下的EPCs，觀察SlP對EPCs的抗凋亡作用。 Kimura，T等人研究了血漿中的脂蛋白對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用的成份，認(rèn)為SlP通過其受體介導(dǎo)了這種保護(hù)作用。同時(shí)，外源性SlP也可模擬出這種對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，提示了SlP對細(xì)胞的抗凋亡作用及應(yīng)

4、用潛能。但是這種物質(zhì)對EPCs的抗凋亡作用及其機(jī)制未見報(bào)導(dǎo)。該物質(zhì)是否能夠在血清和生長因子缺乏的不利環(huán)境中保護(hù)EPCs，減少或阻止EPCs凋亡，保護(hù)局部EPCs，達(dá)到促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)的作用及機(jī)制需要深入研究。 目的： 探討從大鼠骨髓中分離、培養(yǎng)EPCs的方法。觀察無血清狀態(tài)下(用去除血清和細(xì)胞因子后的M199基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞)EPCs的凋亡情況及SlP對這種狀態(tài)下EPCs的抗凋亡作用，并深入探討其機(jī)制。 研究方

5、法： 1.大鼠骨髓來源EPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定：采用密度梯度離心法，從大鼠骨髓中分離單個(gè)核細(xì)胞；采用差速貼壁培養(yǎng)法，在大鼠骨髓中分離出的單個(gè)核細(xì)胞中，培養(yǎng)、擴(kuò)增EPCs。主要從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、對比應(yīng)用多種內(nèi)皮細(xì)胞的特征標(biāo)記及功能檢測等方面證實(shí)所獲細(xì)胞為EPCs，完成細(xì)胞鑒定，為下一步研究提供基礎(chǔ)。 2.無血清培養(yǎng)法誘導(dǎo)EPCs的凋亡情況及SlP對EPCs的保護(hù)作用：對培養(yǎng)出的EPCs采用無血清培養(yǎng)法進(jìn)行誘導(dǎo)凋亡，并用不同濃

6、度(0.1、1、10、20μM)SlP進(jìn)行干預(yù)。光鏡觀察不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。Annexin V-FITC凋亡試劑盒檢測細(xì)胞凋亡率。 3.SlP對無血清狀態(tài)下EPCs保護(hù)作用及機(jī)制的探討：采用RT-PCR及Western blot法證實(shí)EPCs細(xì)胞存在SlP受體。應(yīng)用受體阻滯劑(PTX)，信號通路阻斷劑(U73122、PP2)等，觀察SlP對EPCs在無血清狀態(tài)下抗凋亡能力的改變，用Western blot法檢測各種預(yù)處理后

7、，SlP對EPCs中Akt磷酸化的影響，探討這一過程中抗凋亡作用的信號傳導(dǎo)機(jī)制。同時(shí)對比檢測培養(yǎng)上清中一氧化氮(NO)的含量及EPCs的凋亡率，探討SlP對EPCs的作用機(jī)制。 結(jié)果： 1.從大鼠骨髓細(xì)胞中可分離培養(yǎng)出EPCs。從大鼠骨髓中分離出的細(xì)胞懸液經(jīng)密度梯度離心后，可分離出骨髓來源的單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow-derived mononuclearcells，BMNCs)，；經(jīng)差速貼壁法培養(yǎng)后，可獲得EP

8、Cs。細(xì)胞呈梭狀，可形成集落，符合祖細(xì)胞的特性；培養(yǎng)20天左右，可形成典型“鋪路石”樣內(nèi)皮細(xì)胞。細(xì)胞表達(dá)CD34、KDR、vWF等分子標(biāo)記，但僅分離、培養(yǎng)的早期細(xì)胞表達(dá)CD133，培養(yǎng)9天后，表達(dá)CD133標(biāo)記的細(xì)胞儀占總細(xì)胞的5％。培養(yǎng)的細(xì)胞可吞噬Dil-acLDL，可結(jié)合FITC-UEA-1。RT-PCR檢測出培養(yǎng)、擴(kuò)增后的EPCs中表達(dá)CD31、vWF及eNOS等內(nèi)皮細(xì)胞特征的mRNA。 2.無血清培養(yǎng)法可誘導(dǎo)EPCs凋亡

9、，且凋亡率隨時(shí)間的增加而升高；SlP對去除血清和細(xì)胞因子后的M199基礎(chǔ)培養(yǎng)液(以下簡稱基礎(chǔ)培養(yǎng)液)中的EPCs有抗凋亡作用，且抗凋亡作用隨SlP濃度的增加而增強(qiáng)。無血清培養(yǎng)法在體外明顯導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，使活細(xì)胞數(shù)量減少。24小時(shí)后，EPCs凋亡率為27.7±1.08％；48小時(shí)后凋亡率為為49.3±1.12％。將不同濃度(0.1、1、10、20μM)的SlP加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中進(jìn)行干預(yù)，EPCs凋亡率降低。細(xì)胞凋亡率隨SlP濃度的增加而降低，

10、當(dāng)SlP濃度為20μM時(shí)，幾乎可逆轉(zhuǎn)無血清培養(yǎng)24小時(shí)誘導(dǎo)的EPCs的凋亡作用。 3.SlP通過EPCs膜上G蛋白七次跨膜耦聯(lián)的SlP受體發(fā)揮抗凋亡作用，這種作用與NO升高有關(guān)。RT-PCR及western blot的結(jié)果表明EPCs主要表達(dá)SlP受體1、2、3型；而儀表達(dá)少量的SlP受體4、5型。與對照組相比，在加入了不同濃度(0.1、1、10、20μM)SlP的基礎(chǔ)培養(yǎng)上清中可測得NO水平增加，同時(shí)細(xì)胞凋亡率減少，且呈濃度依

11、量性。在上述各組中加入SlP受體阻斷劑(G蛋白受體阻滯劑百日咳毒素，PTX)后，SlP的抗凋亡作用均被完全抑制。各組間EPCs的凋亡率與對照組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。培養(yǎng)上清中的NO水平與對照組相比差別也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示SlP誘導(dǎo)NO生成增加介導(dǎo)了SlP對EPCs的抗凋亡作用。 4.SlP對EPCs的抗凋亡作用與活化磷酯酶C(Phospholipase C，PLC)和Src激酶有關(guān)。10μM的SlP可顯著減少無血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的細(xì)胞

12、凋亡，加入PLC抑制劑U73122或Scr激酶抑制劑PP2時(shí)，可分別觀察EPCs凋亡率增加，NO產(chǎn)量減少；與對照組相比，加入抑制劑組凋亡率均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)加入U(xiǎn)73122和PP2時(shí)，可消除SlP的抗凋亡作用，與對照組和加入PTX組相比，凋亡率和NO的產(chǎn)生量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其作用與PTX完全阻斷SlP受體作用相似。 5.U73122對SlP誘導(dǎo)的Akt磷酸化的抑制作用不明顯，G蛋白和Src激酶抑制劑可顯著抑制A

13、kt磷酸化的表達(dá)。用western blot法檢測Akt磷酸化可見，加入10μMSlP干預(yù)后的EPCs中Akt磷酸化增加，用U73122預(yù)處理EPCs后，Akt磷酸化與僅用SlP干預(yù)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而用G蛋白抑制劑PTX和Src激酶抑制劑PP2預(yù)處理后，可顯著抑制磷酸化Akt的表達(dá)，與儀用SlP干預(yù)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；G蛋白抑制劑組與Src激酶抑制劑組，磷酸化Akt的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示SlP對EPCs抗凋亡作用是

14、通過SlP受體，再由細(xì)胞內(nèi)兩條單獨(dú)的信號通路介導(dǎo)，生成NO來實(shí)現(xiàn)的。 結(jié)論： 用密度梯度離心法從大鼠骨髓中分離出BMNCs，采用差速貼壁法可培養(yǎng)、擴(kuò)增出EPCs。SlP能有效地減少EPCs在血清及細(xì)胞因子缺乏的環(huán)境中的凋亡。這種保護(hù)作用與激活EPCs膜上SlP受體，誘導(dǎo)NO生成增加有關(guān)；主要通路為SlP/SlP受體/PLC和SlP/SlP受體/Src激酶/Akt這兩種途徑產(chǎn)生NO有關(guān)SlP對體外缺乏血清和細(xì)胞因子環(huán)境中的