BRD7蛋白胞漿-胞核移位的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及細胞凋亡始動功能的分子機制.pdf

1、BRD7是通過eDNA代表性差異分析方法分離克隆的一個bromodomain蛋白家族新成員。該基因具有逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細胞惡性表型，抑制鼻咽癌細胞生長的功能，并通過Ras／MEK／ERK和Rb／E2F兩條通路影響細胞周期進程，使細胞停滯于GO／G1期。同時發(fā)現(xiàn)BRD7能下調(diào)E2F3啟動子活性，分別與核轉(zhuǎn)錄因子IRF2和E1B-AP5發(fā)生交互作用而影響其轉(zhuǎn)錄功能的發(fā)揮，支持BRD7是一個核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。BRD2是一個細胞周期依賴型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，

2、是通過酵母雙雜交系統(tǒng)初步篩選到的一個BRD7交互作用蛋白，并發(fā)現(xiàn)BRD2在鼻咽癌細胞和活檢組織中表達明顯下調(diào)，BRD7的重表達能從mRNA水平上調(diào)BRD2表達水平，提示BRD7與BRD2蛋白間的交互作用在鼻咽癌的發(fā)病過程中發(fā)揮了十分重要作用。 BRD7作為一個與鼻咽癌發(fā)病密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄蛋白，本研究一方面探討B(tài)RD7胞漿／胞核移位的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及功能；另一方面探討其細胞凋亡始動功能的分子機制。 第一部分BRD7核輸入和

3、核輸出功能及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 1．BRD7在不同細胞系中的亞細胞定位模式 應用綠色熒光蛋白(GFP)介導的亞細胞定位方法和Myc靶介導的免疫熒光定位方法，分別考察BRD7在COS7、HeLa和HNEl三種細胞系中的亞細胞定位模式。兩種不同的亞細胞定位方法結(jié)果一致性表明，BRD7均定位于細胞核，以片狀或條梭狀分布，相對均勻，沒有明顯的細胞類型特異性。BRD7在核內(nèi)分布模式同染色質(zhì)的分布存在一定程度的相似性，從側(cè)面支持BRD7是

4、bromodomain蛋白家族的一個新成員。 2．BRD7核定位信號的預測、分離及功能鑒定 BRD7是一個潛在的核轉(zhuǎn)錄蛋白，它在胞漿內(nèi)合成后需要一個進入胞核的過程。在這個核轉(zhuǎn)位過程中，一方面依賴BRD7蛋白本身所固有的核定位信號(NLS)，另一方面需要其它核轉(zhuǎn)運受體蛋白的協(xié)同參與。通過WWW：expasy.ch對BRD7進行結(jié)構(gòu)域搜索，發(fā)現(xiàn)BRD7的65-96位氨基酸具有核定位信號序列(NLS)的特征。通過GFP介導的

5、亞細胞定位方法，發(fā)現(xiàn)這個假定的核定位信號具有介導異源蛋白GFP胞核定位的功能，是一個功能性的核定位信號。通過進一步的結(jié)構(gòu)分析和功能鑒定，發(fā)現(xiàn)該核定位信號由三簇堿性氨基酸殘基組成，可區(qū)分成兩個相互重迭的雙向核靶序列NLS-1和NLS-2，其中NLS-1和NLS-2共用中間一簇堿性氨基酸殘基，并均具有介導異源蛋白GFP胞核定位的功能，可獨立發(fā)揮核定位信號功能的作用。通過構(gòu)建核定位信號缺失的BRD7突變體，利用GFP介導的直接熒光和Myc靶介

6、導的免疫熒光定位方法，發(fā)現(xiàn)缺失性型BRD7定位在胞漿，發(fā)生了胞漿到胞核的移位障礙。說明BRD7的65-96位氨基酸在BRD7的胞核定位模式中發(fā)揮了決定性作用。 3．BRD7核移位障礙對細胞周期和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的影響 分別構(gòu)建野生型BRD7和核定位信號(NLS)缺失型BRD7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HNEl細胞系。通過流式細胞分析發(fā)現(xiàn)野生型BRD7能阻止細胞周期GO/GI→S期進程，而核定位信號缺失型BRD7對細胞周期進程的抑制作用明顯降

7、低。E2F3和cyclinDl是細胞周期Rb/E2F通路中的關(guān)鍵靶分子，通過熒光素酶報告基因分析法，發(fā)現(xiàn)野生型BRD7能顯著下調(diào)E2F3啟動子活性，而缺失型BRD7對其啟動子活性的負性調(diào)節(jié)功能明顯減弱。進一步通過Western Blot分析，發(fā)現(xiàn)缺失型BRD7幾乎喪失了對Rb/E2F通路中關(guān)鍵靶分子E2F3和cyclinDl表達的負性調(diào)節(jié)作用。提示BRD7的胞核分布模式在細胞周期調(diào)控中發(fā)揮了十分關(guān)鍵的作用。 4．BRD7核輸出信

8、號的分離與鑒定 核蛋白存在兩種分布模式，即胞核分布和潛在的胞漿分布模式。胞漿/胞核之間的相互穿梭或轉(zhuǎn)位是蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)的一種重要方式。核蛋白由胞核向胞漿的輸出需要核輸出信號序列和其它受體蛋白的協(xié)同參與。為此,本研究探討B(tài)RD7的核輸出信號序列。首先通過比較NES databases,并結(jié)合核輸出信號所具有的一般結(jié)構(gòu):L-x(2,3)-[LIVFM]-x(2,3)-L-x-[LI](X代表任意氨基酸),搜索具有亮氨酸聚集特征的核輸

9、出信號。發(fā)現(xiàn)BRD7中PL EALN LMR L具有亮氨酸聚集的核輸出信號特征,但進一步功能研究結(jié)果表明,這個假定的核輸出信號不具有介導異源蛋白GFP胞漿定位的功能,且其亞細胞定位或胞漿/胞核分布比例不因為Leptomycin B(LMB)的干預而改變,說明pNES不是BRD7的核輸出信號。 第二部分BRD7的細胞凋亡始動功能及分子機制 1.BRD7的細胞凋亡始動功能 通過流式細胞分析,發(fā)現(xiàn)BRD

10、7在鼻咽癌HNE1細胞中除了存在阻止細胞周期進程的作用外,還具有明顯的細胞凋亡始動功能。同時通過吖啶橙,溴化乙錠(AO/EB)雙色熒光檢測HNEl細胞中凋亡細胞百分數(shù),進一步證實BRD7具有細胞凋亡始動功能。說明BRD7在抑制鼻咽癌細胞增殖過程中同時啟動了阻止細胞周期進程和促進細胞凋亡兩架“馬車”，從而達到逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細胞惡性表型的效果。 2．BRD7對細胞凋亡通路中關(guān)鍵靶分子表達水平的影響 通過Wes，tern Blot

11、分析，發(fā)現(xiàn)在BRD7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HNEl細胞系中，caspase 8和caspase 3的表達明顯上調(diào)，bc卜2的表達明顯下調(diào)。說明BRD7的過表達能夠在蛋白質(zhì)水平上影響Fas介導的細胞凋亡通路中關(guān)鍵靶分子的表達水平，從而導致細胞凋亡的啟動。但BRD7參與細胞凋亡通路的切入點和具體的信號轉(zhuǎn)導通路有待進一步的闡明。 3．BRD7與BRD2蛋白交互作用的鑒定及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) BRD2是通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到的一個BRD7潛在交互作

12、用蛋白，為此本研究聯(lián)合應用免疫共沉淀、GFP介導的直接熒光和Myc靶介導的免疫熒光定位等方法，一方面進一步在哺乳細胞體系中證實BRD7和BRD2蛋白間交互作用；另一方面確定其交互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。結(jié)果表明，BRD2的C-末端截短蛋白(aa 428-798)與BRD7全長蛋白間具有交互作用和共同的亞細胞定位重迭，支持和證實了酵母雙雜交的實驗結(jié)果。 4．BRD2的細胞凋亡始動功能 BRD2(Ring 3)是一個細胞周期依賴型轉(zhuǎn)

13、錄調(diào)節(jié)因子，具有明顯的蛋白激酶活性。通過GFP介導的亞細胞定位方法和Hochest 33258介導的細胞凋亡檢測方法，發(fā)現(xiàn)無論在COS7而是HNEl細胞中，BRD2均定位于細胞核，且在核內(nèi)存在兩種分布模式，即彌散分布和點狀分布；BRD2在COS7和HNEl細胞中均存在明顯的細胞凋亡始動功能，在COS7細胞中的凋亡指數(shù)達到58％±9％，在HNEl細胞中的凋亡指數(shù)為6％±l％，與空白載體GFP對照相比存在顯著差異(P<0.05)。非常有趣的

14、是，BRD2在核內(nèi)成點狀分布的細胞均出現(xiàn)了細胞凋亡的形態(tài)學改變，提示BRD2的這種點狀分布模式可視為細胞凋亡的形態(tài)學標志。同時將pEGFP-C3／BRD2表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染COS7和HNEl細胞，通過流式細胞術(shù)對GFP陽性表達細胞進行凋亡檢測，進一步證實BRD2在COS7和HNEl細胞中均具有細胞凋亡始動功能。 5．BRD7與BRD2之間的功能關(guān)聯(lián) 通過熒光素酶報告基因分析，發(fā)現(xiàn)BRD7和BRD2單獨作用對TNFα啟動子活

15、性沒有明顯影響，但BRD7和BRD2協(xié)同作用能顯著下調(diào)TNFα啟動子活性。說明BRD7和BRD2之間協(xié)同作用更進一步打破了細胞凋亡通路中分子之間的平衡，從而反饋性地引起TNFα啟動子活性的下降。同時前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在BRD7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HNEl細胞中，BRD7的過表達能夠上調(diào)BRD2的mRNA表達水平。這些結(jié)果提示BRD7和BRD2之間存在功能上的緊密關(guān)聯(lián)，BRD7可能通過參與BRD2介導的細胞凋亡通路發(fā)揮細胞凋亡始動功能。 綜

16、上所述，本研究在前期研究確定BRD7為鼻咽癌候選抑瘤基因并定性為一個潛在的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的基礎(chǔ)上，研究了BRD7在不同腫瘤細胞系和永生化原代培養(yǎng)細胞系中的亞細胞定位；分離和鑒定了BRD7的核定位信號和核輸出信號，探討了其胞漿胞核分布模式在細胞周期調(diào)控和細胞生物學功能中的作用；進一步證實了BRD7和BRD2蛋白間的交互作用，初步確定了其交互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；發(fā)現(xiàn)BRD7具有細胞凋亡始動功能，并能影響細胞凋亡通路中關(guān)鍵靶分子bcl-2、cas