NK4慢病毒載體的構(gòu)建及對人肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響.pdf

1、目的：
　　 根據(jù)肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)在腫瘤發(fā)生進展過程中的促進作用和NK4對HGF的拮抗作用,構(gòu)建共表達(dá)人NK4基因和增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因的重組慢病毒載體,轉(zhuǎn)染人高侵襲轉(zhuǎn)移肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)細(xì)胞LM3,觀察其轉(zhuǎn)染效率及表達(dá)情況。研究NK4高表達(dá)后,HCCLM3細(xì)胞增殖、凋亡的改變,及對細(xì)胞侵襲能力的影響。

2、r>　　 方法：
　　 采用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)從HGFcDNA中克隆NK4基因,并經(jīng)測序鑒定。將NK4基因與帶EGFP的慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-內(nèi)部核糖體進入位點序列(IRES)-EGFP融合,構(gòu)建攜帶NK4/EGFP雙基因的慢病毒表達(dá)載體并鑒定。利用293T細(xì)胞進行慢病毒的包裝,將病毒原液濃縮,測定病毒滴度。以不同感染復(fù)數(shù)(MOI)的重組慢病毒感染293T細(xì)胞

3、,篩選出最適MOI轉(zhuǎn)染HCCLM3細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。Westernblot法測定細(xì)胞中NK4蛋白表達(dá)水平。MTT法測定轉(zhuǎn)染NK4后HCCLM3細(xì)胞增殖能力變化。AnnexinV-PE/7-AAD雙染后用流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染NK4對HCCLM3細(xì)胞凋亡的影響。通過Transwell法檢測轉(zhuǎn)染后HCCLM3細(xì)胞侵襲能力的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、PCR獲得目的基因片段,凝膠電泳觀察到約1344bp的特異條帶

4、,經(jīng)酶切鑒定及測序驗證表明NK4基因已經(jīng)成功克隆。NK4克隆質(zhì)粒pMD-19T-NK4與載體plenti6.3-MSC-IRES-EGFP/V5R進行酶切、連接、轉(zhuǎn)化后,對載體進行酶切鑒定,結(jié)果顯示在9300bp附近有一特異性條帶,與預(yù)期相符合,提示含NK4/EGFP雙基因的慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-NK4-IRES2-EGFP構(gòu)建成功,并經(jīng)測序驗證比對一致。
　　 2、構(gòu)建的Lenti6.3-NK4-IRES2-EGF

5、P重組慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞后48h,熒光倒置顯微鏡下可觀察細(xì)胞有綠色熒光表達(dá),轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90%以上。Lenti6.3-NK4-IRES2-EGFP病毒濃縮后,測得病毒的滴度為:1.05×108TU/ml。實驗篩選出的最適MOI=7,轉(zhuǎn)染HCCLM3細(xì)胞后,攜帶NK4基因的HCCLM3細(xì)胞NK4高表達(dá)。Westernblot檢測發(fā)現(xiàn),穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NK4基因的HCCLM3細(xì)胞能夠自分泌分子量約50KD的NK4蛋白。
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6、、MTT法測得HCCLM3/NK4轉(zhuǎn)染組、HCCLM3/空載體組和HCCLM3對照組在各個時間點的細(xì)胞增殖情況顯示,各時間點(除24h外),NK4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長明顯減少,與空載體組、對照組相比有顯著性差異(P＜0.05);空載組和對照組比較,差異無顯著性(P＞0.05)。
　　 4、流式細(xì)胞儀分檢測NK4組、空載體組和對照組細(xì)胞凋亡,NK4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡明顯增加,凋亡率為27.69±2.21%,與空載體組(7.24±0.18%)

7、和對照組(6.51±0.23%)相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);空載體組細(xì)胞凋亡與對照組相比無明顯差異。
　　 5、當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)基中有HGF存在時,對照組和空白載體組的侵襲力顯著高于細(xì)胞培養(yǎng)基中無}tGF。(P＜0.05)存在時,說明HGF可以顯著提高肝癌細(xì)胞的侵襲能力。當(dāng)有HGF存在時,NK4組通過的數(shù)量明顯少于對照組和空載體轉(zhuǎn)染組(P＜0.05);但當(dāng)培養(yǎng)基中無HGF存在是,NK4轉(zhuǎn)染組、空載體組、對照組細(xì)胞通過數(shù)無明

8、顯差異(P＞0.05)。說明NK4可以顯著抑制HGF誘導(dǎo)的HCCLM3細(xì)胞侵襲作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功構(gòu)建含有NK4基因的慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-NK4-IRES2-EGFP質(zhì)粒。經(jīng)測序鑒定及酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期相符,為NK4基因的體外實驗研究提供基礎(chǔ)。
　　 2、用最適MOI轉(zhuǎn)染HCCLM3細(xì)胞后,篩選陽性克隆后進行指標(biāo)檢測,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NK4基因的HCCLM3細(xì)胞可以自分泌NK4蛋白。