microRNA-199a慢病毒載體的構建及其對激素非依賴前列腺癌細胞腫瘤生物學特性的作用研究.pdf

1、一、研究背景及目的
　　 前列腺癌(prostate cancer)是中、老年男性常見的泌尿系惡性腫瘤。其發(fā)病率和病死率分別居全球男性癌癥發(fā)病率的第二位和第六位。在美國，前列腺癌的發(fā)病率位居男性惡性腫瘤之首，居40歲以上男性癌癥死因次席。目前中國等亞洲國家前列腺癌發(fā)病率雖遠低于歐美等發(fā)達地區(qū)，但隨著中國社會老齡化程度的加劇、腫瘤檢測手段的提高及飲食、生活習慣、居住環(huán)境的改變，發(fā)病率呈明顯增長趨勢。因此，前列腺癌越來越受到人們的關

2、注。其發(fā)生、發(fā)展、惡化機制和治療手段研究已經(jīng)成為泌尿外科的熱點研究之一。
　　 前列腺癌(PCa)早期無相關臨床癥狀，雖然目前血清前列腺特異性抗原(PSA)等篩查手段的應用，其檢出率明顯提高，但仍存在相當比例患者在確診前列腺癌時處于疾病進展期:高血清PSA值，高Gleason評分、且發(fā)生局部或遠處骨轉移，從而失去根治性前列腺切除的機會而選擇內(nèi)分泌治療。去勢治療對雄激素依賴型前列腺癌療效確切，包括手術和藥物去勢兩種方法，均可促使腫

3、瘤細胞逐漸凋亡并降低患者PSA水平，緩解疼痛等癥狀，有效延緩腫瘤的惡化及轉移。但內(nèi)分泌治療即最大雄激素阻斷(MAB)的有效時間較短，其中位有效時間僅為14-30月，后期幾乎所有患者都將發(fā)展為雄激素非依賴前列腺癌(AIPC)。對泌尿外科醫(yī)師而言，發(fā)展為雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC)的患者對內(nèi)分泌治療及化療均不敏感且疾病惡化迅速，是無法治愈的階段，患者中位生存時間僅18～20月。研究表明前列腺癌進展與雄激素受體及相關信號通路的改變密切相

4、關，但激素依賴性前列腺癌如何轉變?yōu)榧に胤且蕾囆郧傲邢侔┑臋C制尚不清楚。因此，研究前列腺癌發(fā)生、發(fā)展、惡化、轉移中雄激素受體及信號通路的作用以及受體相關的調(diào)控機制，極大有助于了解前列腺癌從激素依賴轉變激素抵抗的分子機制。
　　 Micro-RNA是內(nèi)源性非編碼RNA分子，由長約18～25個單鏈核苷酸組成。研究表明，眾多Micro-RNA不僅在多肽鏈的合成中發(fā)揮作用，而且能有效調(diào)節(jié)轉錄基因的表達，對細胞增殖、分化、凋亡和代謝等過程起

5、著重要調(diào)節(jié)作用，其對腫瘤細胞生物學特性的調(diào)控是近年來醫(yī)學、生物學等領域研究的熱門，提示生物體內(nèi)存在著由RNA介導的遺傳信息表達調(diào)控網(wǎng)絡。一個Micro-RNA可以調(diào)控多個靶基因，而一個靶基因又可同時被多個Micro-RNA所調(diào)控，不同類型的腫瘤以及腫瘤發(fā)生、進展、惡化中的不同階段，都有自己獨特的Micro-RNA異常表達譜.一般認為在動物細胞中，Micro-RNA主要通過不完全互補的方式與編碼蛋白mRNA的堿基配對結合，引起目標靶mRN

6、A的失活、降解或翻譯受阻，從而在轉錄后水平進行對基因的調(diào)控。
　　 研究認為，microRNA-199a(縮寫為miR-199a)在諸多人類惡性腫瘤中起抑制腫瘤細胞生長的調(diào)控作用，如乳腺癌、大腸癌、骨肉瘤等等，但是有關miR-199a對前列腺癌細胞的作用及相關調(diào)控機制至今未見相關文獻報道。鑒于慢病毒載體系統(tǒng)能高效、穩(wěn)定地將目的基因?qū)氩溉閯游锏脑蚰[瘤細胞系且可以在體內(nèi)長期穩(wěn)定的表達，受免疫、內(nèi)環(huán)境等影響小，安全性較高。我們擬

7、通過基因芯片檢測及臨床腫瘤標本及癌旁組織驗證miR-199a在前列腺癌組織及周圍正常前列腺組織的差異表達，并通過構建miR-199a慢病毒過表達載體研究miR-199a表達水平的變化對前列腺癌激素非依賴細胞腫瘤生物學特性的影響，為后續(xù)針對miR-199a進行前列腺癌的分子靶向治療奠定基礎。
　　 二、研究方法、結果
　　 （一）microRNA-199a慢病毒過表達載體的構建及其效率驗證
　　 慢病毒載體系統(tǒng)能穩(wěn)

8、定、高效地將目的基因?qū)氩溉閯游锏脑蚰[瘤細胞系，且可以在體內(nèi)長期穩(wěn)定的表達，受免疫、內(nèi)環(huán)境等影響小，安全性較高等優(yōu)點。因此我們選擇慢病毒載體體系構建pCDH-miR-199a載體。首先根據(jù)文獻報道及Genebank查詢的相關基因序列，合成特異性引物（帶酶切位點），real-time PCR技術對目的基因片段進行擴增，RT-PCR產(chǎn)物雙酶切及載體酶切后連接到pCDH體系中，經(jīng)過陽性質(zhì)粒轉染293T細胞、慢病毒的獲得、濃縮及滴度測定，通

9、過熒光顯微鏡成像得出我們構建的pCDH-miR-199a慢病毒獲得較高的濃度滴度。慢病毒感染前列腺癌激素非依賴DU-145細胞后，經(jīng)PCR檢測，結果證實構建的pCDH-miR-199a載體能顯著上調(diào)miRNA-199a在DU-145細胞中表達水平。上述實驗結果為后續(xù)進行miRNA-199a表達水平的變化對DU-145細胞腫瘤生物學特性的影響奠定了基礎。
　　 （二）microRNA-199a在臨床前列腺癌(PCa)組織中低表達(

10、16對腫瘤與癌旁組織)
　　 首先利用基因芯片技術發(fā)現(xiàn)miR-199a在臨床前列腺癌標本組織與癌旁正常的前列腺組織之間存在有統(tǒng)計學意義的表達差異。取經(jīng)手術切除的前列腺癌和癌旁正常組織各16例，腫瘤組織的定位根據(jù)術前磁共振(MRI)等影像學檢查、術前穿刺病理報告腫瘤陽性位點、前列腺切除組織的硬度觸摸等手段來大體明確。術后病理切片染色明確所取標本組織包括前列腺癌和周圍正常前列腺組織。所取的標本分別置入液氮中凍存和中性福爾馬林溶液中固

11、定。上述凍存及固定標本經(jīng)RNA抽提、Poly(A)加尾和反轉錄反應、RT-PCR反應，結果發(fā)現(xiàn)16對術后病理診斷明確為前列腺癌與周圍正常癌旁前列腺組織的miR-199a表達水平存在顯著差異，與正常癌旁組織比較，腫瘤組織miR-199a的表達水平顯著下降(P=0.07)。通過上述結果表明，miR-199a極有可能參與調(diào)控了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展及向激素非依賴轉變等病理過程。
　　 （三）miR-199a高表達對前列腺癌細胞DU-14

12、5增殖、遷移、克隆形成及細胞周期與凋亡的影響。
　　 第三部分實驗中，我們通過慢病毒載體介導miR-199a高表達，以研究miR-199a對前列腺癌激素非依賴細胞生物學特性方面的影響。我們選擇DU-145細胞株為研究對象，通過慢病毒載體有效感染前列腺癌DU-145細胞，病毒感染后第五天在倒置熒光鏡下觀察得出慢病毒感染DU-145細胞效率高。通過細胞增殖實驗檢測DU-145細胞生長狀況，與空白和陰性對照組相比，miRNA-199a

13、高表達后的DU-145細胞的增殖能力明顯受到抑制，酶標儀595nm檢測的OD值降低。
　　 我們設計了Transwell實驗研究miRNA-199a高表達后對雄激素非依賴型前列腺癌細胞DU-145遷移能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)，高表達miRNA-199a明顯抑制前列腺癌DU-145細胞的遷移能力。腫瘤的克隆形成能力方面，我們通過DU-145細胞在平板上的克隆形成能力來反應并衡量腫瘤細胞的成瘤能力。我們發(fā)現(xiàn)，通過慢病毒載體介導miRNA

14、-199a高表達后，DU-145細胞的克隆形成能力顯著降低，表現(xiàn)為與con、Lv-shcon組相比，Lv-shmiRNA-199a組克隆的數(shù)目少，克隆的體積小，且克隆分散，成團能力差。在克隆形成實驗中，我們發(fā)現(xiàn)高表達miRNA-199a明顯抑制前列下癌DU-145細胞的克隆形成能力，具體表現(xiàn)為克隆體積小、分散，且成團能力差。為進一步探討miRNA-199a高表達后對前列腺癌DU-145細胞周期產(chǎn)生的影響，我們利用PI染色流式細胞技術來檢

15、測細胞周期分布和細胞凋亡比例，根據(jù)細胞周期各階段所含DNA的不同，來測定細胞的周期分布，結果發(fā)現(xiàn)表明miRNA-199a高表達后能夠?qū)е翫U-145細胞出現(xiàn)G1/S期阻滯。此外，miRNA-199a高表達后能夠促進DU-145細胞出現(xiàn)凋亡。
　　 三、結論
　　 綜合以上三部分實驗結果，我們認為:從芯片檢測及臨床組織標本驗證miRNA-199a在前列腺癌中顯著低表達，慢病毒載體能夠高效、穩(wěn)定的上調(diào)目標靶分子miRNA-1