眼發(fā)育相關(guān)基因CRX及SIX家族成員的蛋白特性分析.pdf

1、隨著社會(huì)的進(jìn)步，遺傳性疾病的發(fā)病率逐年升高，并且絕大多數(shù)遺傳病很難根治，多數(shù)遺傳性疾病又與個(gè)體的發(fā)育直接或間接相關(guān)，所以闡明其發(fā)病機(jī)制對(duì)防治遺傳性疾病有重要的指導(dǎo)意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究通過(guò)了解眼發(fā)育相關(guān)基因CRX(Cone-rod Homeobox)及SIX(Sine Oculis Homeobox Homolog)家族成員(SIX1,SIX3,SIX6)蛋白的特性，探索它們?cè)谶z傳性眼疾發(fā)生發(fā)展中的作用，主要應(yīng)用蛋白復(fù)合體免疫沉淀

2、(protein complex pull-down)等分子生物學(xué)技術(shù)，尋找與CRX蛋白發(fā)生相互作用的蛋白分子，并了解眼發(fā)育相關(guān)基因SIX家族成員對(duì)發(fā)育分化的影響，為后續(xù)進(jìn)一步分析這類遺傳性疾病的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 1.CRX蛋白復(fù)合物成員的分析
　　 目的：分離純化CRX蛋白復(fù)合體的其他蛋白成分，了解CRX蛋白參與的信號(hào)通路。方法：將CRX基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pOZFHN-puro上，通過(guò)在293T細(xì)胞中的瞬

3、時(shí)表達(dá)來(lái)鑒定其載體；制備逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染RB50細(xì)胞，通過(guò)嘌呤霉素篩選，再挑取單克隆細(xì)胞；western blotting檢測(cè)CRX的表達(dá)，大量培養(yǎng)其陽(yáng)性克隆細(xì)胞，制備其核提取物，通過(guò)免疫沉淀法純化CRX蛋白復(fù)合體，最后在梯度凝膠中分離其蛋白復(fù)合體成員并質(zhì)譜測(cè)序分析。
　　 結(jié)果：通過(guò)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)了CRX蛋白能免疫沉淀32種蛋白，其中有7種熱激蛋白、5種解旋酶、5種翻譯因子、4種RNA加工因子、3種核糖核蛋白、2種蛋白激酶、2

4、種血影蛋白、2種組蛋白及2種ATP合成酶。
　　 結(jié)論：CRX蛋白能免疫沉淀32種以前未見(jiàn)報(bào)道的蛋白，表明CRX通過(guò)一個(gè)更復(fù)雜的信號(hào)通路參與到視網(wǎng)膜的發(fā)育。
　　 2.SIX家族蛋白對(duì)發(fā)育分化的影響(Six1基因?qū)2C12細(xì)胞分化的影響)
　　 目的：了解外源性Six1基因的表達(dá)對(duì)C2C12細(xì)胞分化的影響。
　　 方法：將Six1基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pOZFHN-puro上，通過(guò)在293T細(xì)胞中的瞬

5、時(shí)表達(dá)來(lái)鑒定其載體。制備逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染C2C12細(xì)胞，通過(guò)嘌呤霉素的篩選得到陽(yáng)性細(xì)胞；應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)、luciferase分析和western blotting等方法，來(lái)分析Six1對(duì)C2C12細(xì)胞增值與分化的影響。
　　 結(jié)果：外源Six1基因的表達(dá)不改變C2C12細(xì)胞的增值和p21的表達(dá)，也不影響MEF2的表達(dá)，但能通過(guò)抑制Myogenin及Myosin的表達(dá)來(lái)延遲(非抑制)C2C12細(xì)胞的分化。
　　 結(jié)論：Six