呼吸道合胞病毒分離培養(yǎng)及其F蛋白基因變異分析.pdf

1、第一部分巢式PCR與病毒分離培養(yǎng)對(duì)RSV檢測(cè)的差異及其臨床意義分析
　　 目的:探討巢式PCR(N-PCR)、病毒分離培養(yǎng)兩種不同方法檢測(cè)呼吸道合胞病毒(RSV)的差異性及其差異性提示的臨床意義。
　　 方法:收集2010年1月-2012年8月呼吸病房住院患兒鼻咽抽吸物(NPAs)，同時(shí)采用N-PCR、病毒分離培養(yǎng)方法檢測(cè)RSV。采集患兒臨床資料，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:1143份病例中，N-PCR檢出RS

2、V陽(yáng)性共458份（總陽(yáng)性率:40.1％，其中RSVA31.7％; RSVB為7.7％;RSVA及RSV B同時(shí)檢出標(biāo)本0.7％)。病毒分離培養(yǎng)方法檢出RSV陽(yáng)性標(biāo)本204份(17.8％)。分析N-PCR及病毒分離培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果:兩種方法檢測(cè)均陽(yáng)性(P+I+)標(biāo)本共165份，均陰性標(biāo)本(P-I-)646份（一致性為70.1％），兩種方法差異最大部分在于N-PCR陽(yáng)性、病毒分離培養(yǎng)陰性的（P+I-）標(biāo)本共293份，占總標(biāo)本數(shù)25.6％。P+I

3、-組與P-I-組比較有如下臨床特點(diǎn):患兒年齡小、住院時(shí)間長(zhǎng);RSV檢出率冬季最高、夏季最低;發(fā)熱患兒比例低;咳痰、喘息、呼吸困難、重癥肺炎、呼吸衰竭患兒比例較高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，臨床符合RSV感染的特征。P+I-組與P+I+組比較具有患兒入院前病程更長(zhǎng)(P=0.005)，喘息患兒比例低(P=0.009)的特點(diǎn)。
　　 結(jié)論:N-PCR和病毒分離培養(yǎng)兩種方法對(duì)RSV檢出的差異性與患兒入院前病程有關(guān)，推測(cè)隨著病程

4、延長(zhǎng)患兒呼吸道RSV滴度降低導(dǎo)致病毒分離培養(yǎng)陽(yáng)性率下降。P+I-組符合RSV感染的特征，其臨床特點(diǎn)與該組患兒處于病程后期病毒滴度較低有關(guān)。N-PCR檢測(cè)RSV的敏感性及特異性良好。
　　 第二部分呼吸道合胞病毒F蛋白基因變異及帕利珠單抗對(duì)臨床分離株的中和能力分析
　　 背景:RSV是嬰幼兒時(shí)期急性下呼吸道感染最主要的病毒病原體。F蛋白是RSV重要的表面糖蛋白之一，F(xiàn)蛋白不僅是HLA限制性CTL細(xì)胞識(shí)別的靶蛋白還是中和抗體

5、識(shí)別的靶點(diǎn)，目前唯一應(yīng)用于臨床預(yù)防高危患兒RSV感染的帕利珠單抗即與F蛋白結(jié)合。研究F蛋白分子流行病學(xué)對(duì)于RSV的疫苗研發(fā)有相當(dāng)重要。
　　 目的:研究中國(guó)重慶地區(qū)RSV F蛋白基因變異、CTL識(shí)別表位的變異及帕利珠單抗對(duì)臨床分離株的中和能力。
　　 方法:采集2009年6月-2012年3月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸一病房因急性下呼吸道感染住院的患兒鼻咽抽吸物共1800份。標(biāo)本進(jìn)行RSV病毒分離培養(yǎng)，提取RSV臨床株的

6、核酸，逆轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增F基因全長(zhǎng)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)測(cè)序，序列拼接。用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析及分析CTL識(shí)別表位變異情況。用western blot及微量中和試驗(yàn)的方法驗(yàn)證帕利珠單抗與臨床分離株的結(jié)合能力。
　　 結(jié)果:分離RSV臨床株333例，陽(yáng)性率為18.5％(RSVA:277;RSVB:55; RSVA與RSV B同時(shí)陽(yáng)性標(biāo)本1例)。對(duì)107例RSVA，23例RSV B進(jìn)行F基因全長(zhǎng)測(cè)序。系統(tǒng)進(jìn)化分析提示RSVF基因高

7、度保守，在氨基酸位點(diǎn)16，25，45，102，122，124，209及447存在顯著的氨基酸變異，同時(shí)也存在HLA限制性CTL識(shí)別表位氨基酸變異。在RSVA臨床分離株中，帕利珠單抗結(jié)合的抗原位點(diǎn)276存在氨基酸天冬酰胺→絲氨酸(N→S)的變異，且有09年-12年逐年增加的趨勢(shì)。Western blot及微量中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)在位點(diǎn)276 N→S的變異不影響帕利珠單抗與RSV A臨床分離株的結(jié)合。
　　 結(jié)論:中國(guó)地區(qū)RSV F基因