siRNA對食管鱗癌EC9706細胞中paxillin表達及遷移能力影響的研究.pdf

1、食管癌是一種較為常見的惡性腫瘤之一,居世界癌癥死亡的第六位。其發(fā)病率受地區(qū)的影響較大,尤其在河南省林州市的發(fā)病率高達100/10萬以上。食管癌的發(fā)生與某些地區(qū)人民的生活習慣、自然環(huán)境等因素密切相關,但其確切的病因至今未明了。目前食管癌的治療還主要局限在手術治療、放射治療、藥物治療和免疫治療等方法,但這些方法均不能達到令人滿意的效果,而腫瘤的浸潤、轉移在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用。siRNA在腫瘤領域中的應用是一個新興發(fā)展的產業(yè)

2、,由于其高效、低毒及快捷等特點而受到醫(yī)學界同行的廣泛關注,因此尋找食管癌新的分子治療靶點近年來愈來愈受到廣泛關注。paxillin是近年來發(fā)現的一種重要的細胞黏附因子,是致瘤性酪氨酸激酶的一種底物,可以調節(jié)細胞的移動和播散等功能,從而提高腫瘤細胞轉移和侵襲的能力。多項研究表明paxillin有參與動態(tài)調節(jié)黏著斑、調節(jié)細胞的移動和播散等功能。而腫瘤的浸潤和轉移與細胞的黏附力、移動力的改變直接相關,提示paxillin在腫瘤細胞的浸潤和轉移

3、中起著十分重要的作用。整合素介導的信號轉導過程中的關鍵信號分子FAK在腫瘤侵襲轉移中起到非常重要的作用。
　　研究發(fā)現FAK在細胞粘附、運動及信號轉導中起重要作用,而且還調節(jié)著多細胞生物的分裂、塵長、發(fā)育和凋亡等生物學行為。目前已發(fā)現FAK在人類許多不同類型的腫瘤中呈過度表達,而在良性腫瘤或正常組織中無顯著增高。FAK在腫瘤向惡性侵襲表型演進過程中起重要作用,其與腫瘤侵襲的高度相關性已在一些研究中得已證實。paxillin和FAK

4、均是與細胞粘附相關的蛋白,是整合素介導的信號調控途徑中的兩個關鍵性的信號分子。近來研究表明,paxillin和FAK在細胞遷移、細胞增殖和生存中起著十分重要的作用。目前,paxillin和FAK蛋白作為整合素介導的信號轉導途徑中的兩個關鍵性的信號分子,在食管鱗癌、胃癌、大腸癌、肝癌、乳腺癌、喉鱗狀細胞癌、肺癌等不同的腫瘤組織中的作用均有不同程度的報道,然而,paxiltin和FAK的聯合檢測在食管鱗癌EC9706細胞中的作用以及利用si

5、RNA技術抑制paxillin基因的表達引起的食管鱗癌細胞相應的生物學行為的變化也未見報道。
　　因此,本研究利用paxillin siRNA轉染食管鱗癌EC9706細胞,通過免疫細胞化學、半定量RT-PCR及Western blotting方法研究paxillin基因表達的下調對食管鱗癌EC9706細胞中FAK和MMP-2的表達的影響,初步闡明三者相互調控之間的關系,進一步通過Boyden chamber研究其對細胞遷移能力的影

6、響。該研究旨在通過研究食管鱗癌浸潤轉移調控途徑,進一步利用現代分子生物學技術阻斷信號途徑中的關鍵調控基因,為食管鱗癌的轉移機制提供新的理論依據和實驗基礎。
　　方法：1.paxillin siRNA轉染食管鱗癌EC9706細胞將paxillin siRNA利用脂質體2000轉染食管鱗癌EC9706細胞,于48h后收集細胞,用于下面的免疫細胞化學、半定量RT-PCR、Western blotting以及細胞侵襲實驗。
　　2.

7、免疫細胞化學分析paxillin和FAK蛋白的表達將上述收集好的細胞,分別爬片,然后利用免疫細胞化學法檢測paxillin和FAK蛋白的表達。
　　3.半定量RT-PCR分析paxillin、FAK及MMP-2 mRNA的表達根據操作說明用Trizol試劑提取總RNA,然后用AMV First Strand DNASynthesis試劑盒合成cDNA第一鏈。利用合成的特異性PCR引物進行擴增,利用β-actin作為內參。擴增結束進

8、行電泳檢測,并利用Gene Tools進行基因相對表達分析。
　　4.Western blotting分析paxillin、FAK及MMP-2蛋白的表達將上述收集的細胞在裂解緩沖液中進行裂解。然后將收集的總蛋白于10％SDS-PAGE電泳,通過電轉移至硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜用含5％脫脂奶粉的PBS-T于室溫封閉2小時,然后分別加一抗(paxillin,FAK,MMP-2及β-actin)于含1％脫脂奶粉的PBS-T進行稀釋,

9、接著加兔抗連接辣根過氧化物酶的二抗,最后用Gene Tools進行蛋白相對表達量分析。
　　5.Boyden chamber分析轉染前后細胞遷移能力的變化將各組細胞接種于上層,Boyden chamber實驗計算各組穿膜的細胞數,然后比較轉染paxillin siRNA后EC9706細胞遷移能力的變化。
　　6.統計學處理免疫細胞化學采用χ~2檢驗;RT-PCR和Western blotting結果均采用GeneTools軟

10、件進行灰度值分析,上述試驗均分別重復三次。統計學處理均采用SPSS13.0統計軟件,統計學數據用均數±標準差(±s)表示,行單因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05具顯著性。
　　結果：1.免疫細胞化學檢測paxillin和FAK蛋白的表達免疫細胞化學結果顯示,三組細胞中轉染paxillin siRNA組中paxillin和FAK蛋白表達陽性細胞數最低(P<0.05),而未處理組和轉染siRNA對照組中其表達陽性

11、細胞數較高,但兩者之間統計學上無差異(P>0.05)。
　　2.半定量RT-PCR分析paxillin、FAK及MMP-2 mRNA的表達轉染paxillin siRNA后,與對照組及轉染空載體對照組相比,轉染paxillinsiRNA組中的paxillin mRNA的表達量明顯下調。此外,FAK及MMP-2 mRNA相對含量也顯著下調。
　　3.Western blotting分析paxillin、FAK及MMP-2蛋白的

12、表達轉染paxillin siRNA后,與對照組及轉染空載體對照組相比,轉染paxillinsiRNA組中的paxillin蛋白的表達量明顯下調。此外,FAK及MMP-2蛋白相對含量也顯著下調。
　　4.Boyden chamber分析轉染前后細胞遷移能力的變化結果表明,與未處理組及轉染siRNA對照組相比,轉染paxillin siRNA組穿膜的細胞數明顯下降(P<0.05),但未處理組及轉染siRNA對照組相比,在統計學上無差