P2X-,7-受體在雌激素促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7增殖中的作用.pdf

1、雌激素是一種作用廣泛的類固醇類激素，對(duì)生殖系統(tǒng)、乳腺、骨骼及心血管系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育功能有調(diào)節(jié)作用。雌激素的活性失調(diào)可導(dǎo)致相關(guān)性腫瘤及疾病的發(fā)生。已有研究顯示，雌激素受體在諸多腫瘤組織和細(xì)胞株中均有表達(dá)，如生殖系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、消化系統(tǒng)腫瘤、泌尿系統(tǒng)腫瘤、頭頸部腫瘤、血液系統(tǒng)腫瘤等。乳腺癌被認(rèn)為是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性雌激素水平持續(xù)增高或外源性補(bǔ)充雌激素均可使乳腺癌發(fā)病率明顯增加。體外研究也表明雌

2、激素促進(jìn)乳腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和雌激素受體陽(yáng)性乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲。
　　 雌激素主要是通過(guò)與雌激素受體(estrogen receptor，ER)結(jié)合起來(lái)發(fā)揮作用。ER有兩種作用模式，經(jīng)典的作用模式是雌激素與雌激素受體結(jié)合，通過(guò)靶基因上游的雌激素反應(yīng)元件(estrogen reactive element，ERE)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，這種機(jī)制被稱為雌激素的基因組作用模式(或稱核啟動(dòng)的雌激素應(yīng)答)，需要雌激素與ER形成復(fù)合體后轉(zhuǎn)移至細(xì)

3、胞核才能發(fā)揮作用，同時(shí)ER還可以通過(guò)招募共激活因子的途徑與其他一些調(diào)控細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)錄因子，如AP-1和c-Jun等相互作用激活一些基因的轉(zhuǎn)錄。雌激素還存在非基因組作用模式(或稱膜啟動(dòng)的雌激素應(yīng)答)，通過(guò)分布于細(xì)胞膜的雌激素結(jié)合蛋白，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，從而改變胞內(nèi)蛋白功能和調(diào)控基因表達(dá)。
　　 目前已發(fā)現(xiàn)的與人類相關(guān)的雌激素受體亞型為ERα和ERβ兩種亞型。而由于ERα和ERβ兩種亞型配體結(jié)合區(qū)氨基酸系列同源性只為55％，該配體結(jié)合

4、區(qū)氨基酸系列差異是ERα和ERβ兩種亞型各自具有獨(dú)物特轉(zhuǎn)錄作用的關(guān)鍵。使得ERα和ERβ具有不同的調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性，最終發(fā)揮不同的臨床作用。ERα主要是作為基因轉(zhuǎn)錄的激動(dòng)劑，而ERβ主要是作為基因轉(zhuǎn)錄的抑制劑。在ER亞型的表達(dá)對(duì)乳腺癌的預(yù)后的研究中，ERα與預(yù)后呈正相關(guān)是被普遍認(rèn)可的，研究認(rèn)為ERα水平上調(diào)，促進(jìn)腫瘤壞死因子(TGF)-α表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。而在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中，ERα、ERβ兩者在其發(fā)展過(guò)程中作用相反。

5、>　　 ATP不僅是一種貯能、供能物質(zhì)，還是一種細(xì)胞間信息傳遞物質(zhì)，通過(guò)激活P2X(配基門(mén)控性非選擇性陽(yáng)離子通道，7個(gè)亞型)和P2Y(G一蛋白耦聯(lián)，8個(gè)亞型)受體而產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。P2X7受體因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能，是近年研究的熱點(diǎn)。其受體廣泛表達(dá)在多種組織，生理功能呈多樣性。包括過(guò)氧化物和NO的生成，T細(xì)胞的激活和成熟，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞形成膜泡等。P2X7受體的異常表達(dá)與腫瘤、炎癥等相關(guān)。大量的研究發(fā)現(xiàn)，P

6、2X7受體廣泛表達(dá)在上皮性腫瘤組織或細(xì)胞中：1)腫瘤組織或細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)正常組織或細(xì)胞，如甲狀腺癌、前列腺癌等；2)腫瘤組織或細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于對(duì)應(yīng)正常組織或細(xì)胞，如外胚層來(lái)源的皮膚、泌尿生殖竇的膀胱及宮頸陰道部以及苗勒管來(lái)源的內(nèi)宮頸和子宮內(nèi)膜部。
　　 2002年，Carley等對(duì)大鼠膀胱中P2X受體的研究結(jié)果顯示：去卵巢大鼠膀胱中P2X3受體表達(dá)明顯增加。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸至炎情況下，雌激素促進(jìn)大鼠

7、背根神經(jīng)節(jié)P2X3 mRNA的表達(dá)，而下調(diào)P2Y1 mRNA的表達(dá)。提示雌激素可能對(duì)ATP受體的表達(dá)和功能有調(diào)節(jié)作用。因而我們推測(cè)在雌激素依賴的腫瘤細(xì)胞中，雌激素可能也對(duì)ATP受體的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，從而來(lái)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、增殖凋亡。但迄今為止，這方面的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 已有研究發(fā)現(xiàn)，基于以上的推測(cè)，我們想通過(guò)對(duì)雌激素依賴性腫瘤細(xì)胞中ATP受體的研究，以及雌激素對(duì)ATP受體及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用，將為闡明雌激素對(duì)

8、惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展的作用提供新的線索；為研制新一代的抗腫瘤藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目前僅有乳腺癌的ER研究較為深入，對(duì)于乳腺癌，雌激素受體是它的生物學(xué)標(biāo)志物，是目前比較可靠的指導(dǎo)治療和判定乳腺癌預(yù)后的重要指標(biāo)。同時(shí)已有的研究發(fā)現(xiàn)：1)乳腺癌細(xì)胞MCF-7本身可以分泌ATP，2)外源性ATP可以抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　 故本實(shí)驗(yàn)先以ER(+)乳腺癌細(xì)胞MCF-7為模型，觀察細(xì)胞上P2X7受體的表達(dá)和對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)

9、的作用，以及雌激素可能通過(guò)對(duì)P2X7受體表達(dá)的調(diào)節(jié)功能從而來(lái)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、增殖凋亡。以雌激素與ATP受體的相互關(guān)系的基礎(chǔ)研究為前提，為我們后續(xù)進(jìn)行激素依賴性腫瘤(如子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌)的研究提供理論基礎(chǔ)，和為更好地開(kāi)展臨床治療和評(píng)估預(yù)后提供對(duì)策及抗腫瘤新藥研發(fā)提供合理的靶向。
　　 第一部分乳腺癌中P2X7受體的表達(dá)
　　 目的：研究乳腺癌中P2X7受體的表達(dá)與ER受體的相關(guān)性。
　　 方法：為了明確乳腺癌

10、中P2X7受體表達(dá)與雌激素受體的相關(guān)性，我們對(duì)臨床收集的乳腺癌石蠟切片標(biāo)本包括乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及癌旁正常組織(乳腺癌又分ER陽(yáng)性,ER陰性)共64例進(jìn)行了P2X7受體的免疫組化檢測(cè)。
　　 結(jié)論：乳腺導(dǎo)管癌中P2X7受體的表達(dá)與雌激素受體ER的表達(dá)，呈正相關(guān)性。
　　 第二部分乳腺癌細(xì)胞MCF-7中P2X7受體的表達(dá)以及其與雌激素對(duì)細(xì)胞增殖的影響
　　 目的：乳腺癌細(xì)胞MCF-7中P2X7受體的表達(dá)；雌激素和P2

11、X7受體對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響。
　　 方法：1.瓊脂糖凝膠電泳
　　 2. MTT法雌激素及拮抗劑ICI182780，雌激素選擇性拮抗劑[雌激素ERα拮抗劑(MPP，5×10-5mol/L)，雌激素ERβ拮抗劑(PHTPP，5×10-5mol/L)]，P2X7受體激動(dòng)劑(BzATP)及拮抗劑(PPADS)，雌激素處理后P2X7受體拮抗劑對(duì)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響。
　　 結(jié)論：雌激素通過(guò)雌激素受體ERα對(duì)

12、MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)有促增殖作用；P2X7受體對(duì)MCF-7細(xì)胞也有促增殖作用。
　　 第三部分雌激素對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7中P2X7受體mRNA和蛋白表達(dá)的影響
　　 目的：研究雌激素對(duì)P2X7受體mRNA和蛋白表達(dá)的調(diào)控作用
　　 方法：實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡法檢測(cè)雌激素及拮抗劑ICI182780，雌激素選擇性拮抗劑[雌激素ERα拮抗劑(MPP)，雌激素ERβ拮抗劑(PHTPP)]處理后，P2X7受體mRNA