玉米自交系1145 BAC文庫的構(gòu)建及抗甘蔗花葉病毒基因Scmv1區(qū)域BAC克隆的篩選.pdf

1、玉米自交系1145高抗玉米青枯病、甘蔗花葉病毒病、大斑病等玉米生產(chǎn)上的主要病害。以此自交系為材料構(gòu)建我國玉米的細(xì)菌人工染色體文庫(BAC)具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)用兩種限制性內(nèi)切酶(HindⅢ和BamHI)分別部分酶切玉米自交系1145的基因組DNA，回收100kb以上的酶切片段，分別與pIndigoBAC-5載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物通過電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到大腸桿菌DH10B菌株的感受態(tài)細(xì)胞中，每次轉(zhuǎn)化獲得的BAC克隆數(shù)為1,000-3,000個(gè)

2、。獲得的克隆數(shù)總共為221,184個(gè)，保存在576塊384孔板中。從中隨機(jī)挑取96個(gè)單克隆進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示平均插入片段大于100kb，空載率低于3％。按玉米基因組2,500Mb計(jì)，構(gòu)建的1145BAC庫約覆蓋玉米9倍基因組大小。為了便于采用PCR方法進(jìn)行BAC文庫的篩選，將96個(gè)單克隆混成一個(gè)BAC亞池，每24個(gè)BAC亞池混成一個(gè)超級(jí)池，最終得到了2,304個(gè)亞池和96個(gè)超級(jí)池。通過堿裂解法提取超級(jí)池的BAC質(zhì)粒用于BAC文庫的篩選。