PD-1-PD-L1路徑對(duì)人動(dòng)脈粥樣硬化免疫調(diào)控的研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥性疾病，以強(qiáng)烈的免疫活化為特征，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。目前已明確，無(wú)論是在人體還是小鼠模型，各個(gè)發(fā)展階段的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊均存在大量的T淋巴細(xì)胞，包括CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群。目前尚無(wú)充足的證據(jù)能完全闡明AS病理過(guò)程中的免疫調(diào)控機(jī)制。
　　B7/CD28家族成員相關(guān)路徑在調(diào)控T細(xì)胞相關(guān)的刺激性與抑制性信號(hào)的平衡方面起關(guān)鍵作用

2、，從而對(duì)抗微生物感染及實(shí)現(xiàn)自身免疫耐受。該類路徑提供第二信號(hào)調(diào)控T細(xì)胞反應(yīng)的激活、抑制及微調(diào)。過(guò)去幾年研究發(fā)現(xiàn)，B7/CD28家族有許多能削弱T細(xì)胞應(yīng)答并促進(jìn)T細(xì)胞耐受的抑制性信號(hào)通路，其中近年發(fā)現(xiàn)的程序性死亡因子-1（PD-1）及其配體（PD-L）通路由于獨(dú)特的抑制功能引人矚目，被認(rèn)為是影響自身免疫和感染性疾病慢性化的重要因素。PD-1也稱CD279，屬于免疫球蛋白超家族成員，主要與抗原提呈細(xì)胞（antigenpresentingce

3、lls，APCs）表面的PD-L1和PD-L2（分別又稱為B7-H1和B7-DC）結(jié)合后抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)。干擾素α、β和γ是強(qiáng)有力的PD-L1表達(dá)上調(diào)因子，可促進(jìn)PD-L1表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞。PD-1具有整合功能，可通過(guò)與PD-L的相互作用整合DC的信號(hào)，繼而控制T細(xì)胞耐受和活化。目前，PD-1/PD-L路徑正逐漸成為重要的T細(xì)胞反應(yīng)調(diào)控子，控制慢性感染性疾病及自身免疫疾病的過(guò)程。其中，PD-1/PD-L路徑與DC

4、-T細(xì)胞相互作用之間的關(guān)系更是受到了廣泛關(guān)注。作為體內(nèi)抗原提呈能力最強(qiáng)的APCs，DC在免疫調(diào)控方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。相對(duì)于PD-L2的作用而言，DC表面的PD-L1更值得關(guān)注。最新研究發(fā)現(xiàn)，在PD-L1/2-/-LDLR-/-小鼠模型體內(nèi)，高膽固醇血癥及其導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣病變?yōu)橄到y(tǒng)免疫性疾病，受PD-1/PD-L1/2路徑的調(diào)節(jié)。這一路徑是否影響了人體內(nèi)T細(xì)胞對(duì)高膽固醇血癥或其他相關(guān)抗原的反應(yīng)及相應(yīng)的動(dòng)脈病變的進(jìn)展，目前尚無(wú)報(bào)道。<

5、br>　　本研究以動(dòng)脈粥樣硬化患者為研究對(duì)象，取外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC），分別檢測(cè)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞與髓系樹(shù)突狀細(xì)胞（myeloiddendriticcells，mDCs）表面的PD-1與PD-L1的表達(dá)水平，并分析其表達(dá)水平的高低與細(xì)胞免疫活性之間的關(guān)系，如mDCs刺激T細(xì)胞增殖的能力和分泌細(xì)胞因子的能力等；干擾素體外干涉PD-L1的表達(dá)，研究其表達(dá)變化對(duì)免疫

6、活性的影響，以期闡明PD-1/PD-L1路徑對(duì)機(jī)體免疫過(guò)程的影響及其在動(dòng)脈粥樣硬化病變過(guò)程中所發(fā)揮的作用，從而為AS的免疫調(diào)控治療提供新的理論依據(jù)。為此，本研究主要完成了以下三方面的工作：
　　1.標(biāo)本的收集、細(xì)胞因子檢測(cè)及PBMC表面PD-1/PD-L1的表達(dá)特點(diǎn)分析
　　按入選標(biāo)準(zhǔn)篩選我科確診的動(dòng)脈粥樣硬化病人，肝素抗凝管收集其外周血，并整理相關(guān)臨床資料；分離外周血PBMC；ELISA法檢測(cè)患者血清中IFN-γ、IL-2

7、、IL-10和IL-12等細(xì)胞因子的濃度；利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)入選患者外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞表面PD-1及PD-L1的表達(dá)水平，檢測(cè)mDCs表面PD-L1的表達(dá)水平，以健康志愿者作對(duì)照。
　　2.PD-1/PD-L1路徑對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化患者T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響
　　細(xì)胞陽(yáng)性分離試劑盒分離純化CD4+、CD8+T細(xì)胞及mDCs，用患者及健康人的mDCs與非自體健康人的CD4+或CD8+T細(xì)胞混合培養(yǎng)，以同種異體淋巴細(xì)胞

8、增殖反應(yīng)為基礎(chǔ)，采用[3H]-TdR摻入法和ELISA法分別檢測(cè)細(xì)胞的增殖和細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的濃度。
　　3.體外刺激PD-L1上調(diào)后mDCs功能改變及其對(duì)T細(xì)胞的影響
　　α干擾素可在體外短期內(nèi)上調(diào)PD-L1在mDCs表面的表達(dá)，本研究利用α干擾素作為PD-L1的正性調(diào)控因素，通過(guò)α干擾素對(duì)mDCs的作用，研究上調(diào)PD-L1表達(dá)對(duì)mDCs刺激T細(xì)胞增殖能力的影響及細(xì)胞因子分泌功能的影響。同樣以異體淋巴細(xì)胞增殖

9、反應(yīng)為基礎(chǔ)，采用[3H]-TdR摻入法和ELISA法檢測(cè)細(xì)胞的增殖和細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的濃度。
　　結(jié)果：
　　1.動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血中CD4+、CD8+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)百分比下降，CD4+T細(xì)胞、mDCs表面PD-L1的表達(dá)百分比下降。
　　2.動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血中促炎細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-12）水平明顯增高，而抗炎細(xì)胞因子IL-10則明顯降低，且穩(wěn)定性心絞痛組與急性冠脈綜

10、合征組也有明顯差異（可能是急性冠脈綜合征時(shí)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)的結(jié)果）。
　　3.異體淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)顯示，患者的mDCs刺激異源性CD4+或CD8+T細(xì)胞增殖的能力和分泌I型效應(yīng)細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-2）的能力比健康人的mDCs明顯升高；細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12的濃度明顯升高，而IL-10的濃度則明顯降低，說(shuō)明患者mDCs與T細(xì)胞之間的相互作用能力較健康人增強(qiáng)。
　　4.α干擾素可以上調(diào)mDCs表面PD-L1的表達(dá)，造成mD

11、Cs刺激異體CD4+或CD8+T細(xì)胞增殖的能力下降，促炎細(xì)胞因子分泌水平降低；同時(shí)，PD-L1表達(dá)的上調(diào)使mDCs與T細(xì)胞之間的相互作用能力下降，IL-12濃度降低，而IL-10濃度升高。
　　結(jié)論：
　　1.程序性死亡因子1及其配體表達(dá)水平在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中下調(diào)，影響了淋巴細(xì)胞與mDCs之間的相互作用，使T細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，炎性細(xì)胞因子分泌水平升高，炎癥過(guò)程加劇。
　　2.PD-1/PD-L1路徑可能在動(dòng)脈粥樣硬化