慢病毒介導(dǎo)NT-3基因轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)生物學(xué)特性研究.pdf

1、研究背景和目的：神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cells，NSCs)移植和基因治療，是治療缺血性腦血管疾病的兩個(gè)重要的研究途徑。近年來(lái)，神經(jīng)干細(xì)胞已經(jīng)被用作基因治療的載體，可將治療基因攜帶到病灶，通過(guò)治療基因在缺血性損傷局部表達(dá)而發(fā)揮作用，有望為中風(fēng)的治療帶來(lái)新的希望。 本研究的目的：以慢病毒(Lentivirus，LV)介導(dǎo)，將hNT-3基因轉(zhuǎn)入NSCs，并進(jìn)行體外培養(yǎng)，探討NSCs-hNT3在體外分化以及表達(dá)NT-3時(shí)

2、間上的特點(diǎn)，為體內(nèi)移植NSCs-hNT3的研究和臨床應(yīng)用提供必要的體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：實(shí)驗(yàn)共分二部分。第一部分：從孕14天Sprague-Dawley(S-D)大鼠胚胎的腦組織分離出神經(jīng)干細(xì)胞，采用無(wú)血清培養(yǎng)法，進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，并通過(guò)免疫熒光化學(xué)染色(巢蛋白)進(jìn)行鑒定。取傳至第5～6代神經(jīng)干細(xì)胞，以1×105cells/500μl/孔接種于24孔板，分別按復(fù)感染指數(shù)(Multiplicities of infection，

3、MOIs值)為0、1、5、10、15、20加入攜帶報(bào)告基因GFP的慢病毒載體(lentiviral vector-GFP，LV/GFP)稀釋液，每一滴度加六孔，共六組。2～3天后于倒置熒光顯微鏡下觀察各組GFP的表達(dá)效率，并在3天后進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞球進(jìn)行計(jì)數(shù)，觀察LV/GFP對(duì)NSCs增殖的影響。并行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，得出各組NSCs的GFP陽(yáng)性轉(zhuǎn)染率。第二部分：構(gòu)建表達(dá)hNT-3基因的慢病毒載體(lentiviral vector-hNT

4、-3，LV/hNT-3)，實(shí)驗(yàn)組根據(jù)最佳MOI用LV/hNT-3轉(zhuǎn)染NSCs，對(duì)照組NSCs不轉(zhuǎn)染病毒。兩組細(xì)胞繼續(xù)無(wú)血清培養(yǎng)，48h～96h后，應(yīng)用ELISA和免疫熒光染色方法對(duì)兩組NSCs在體外的分化和NT-3的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果：第一部分：NSCs以懸浮細(xì)胞球方式生長(zhǎng)，nestin染色陽(yáng)性。轉(zhuǎn)染GFP基因后，除MOI值為0的對(duì)照組外，2～3天后各孔均有GFP表達(dá)。MOI值從0增至10，細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸提高(P<0.0

5、5)，MOI值為10的組能獲得>85％的轉(zhuǎn)染率。但MOI值從10增至20，形成的神經(jīng)干細(xì)胞球數(shù)目卻逐漸減少。第二部分：NT-3修飾的神經(jīng)干細(xì)胞早期跟親代無(wú)形態(tài)學(xué)區(qū)別，3-4天后，實(shí)驗(yàn)組中神經(jīng)干細(xì)胞分化比例比對(duì)照組明顯要高，已分化的細(xì)胞在形態(tài)上與對(duì)照組比較：細(xì)胞突起長(zhǎng)而且數(shù)量多，細(xì)胞間突觸聯(lián)系多。轉(zhuǎn)NT-3組神經(jīng)干細(xì)胞，向神經(jīng)元方向分化的比例明顯高于對(duì)照組。 結(jié)論： 1)LV是將外源基因轉(zhuǎn)入神經(jīng)干細(xì)胞的理想載體。以MOI為