人源性成體腸神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究和生物學(xué)特性初探.pdf

1、第一部分:人源性成體腸神經(jīng)干細(xì)胞的提取、培養(yǎng)和鑒定
　　目的:對(duì)體外培養(yǎng)得到的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和免疫學(xué)鑒定，明確得到的細(xì)胞為腸神經(jīng)干細(xì)胞。
　　方法:從先天性巨結(jié)腸及腸閉鎖患兒手術(shù)切除腸管中分離提取培養(yǎng)出腸神經(jīng)干細(xì)胞，利用無血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)，光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄其變化，取原代培養(yǎng)形成的神經(jīng)球經(jīng)accutase酶消化后采用有限稀釋法進(jìn)行克隆成球試驗(yàn)，倒置相差顯微鏡觀察并拍照記錄。利用含10％胎牛血

2、清的分化培養(yǎng)基自然誘導(dǎo)腸神經(jīng)干細(xì)胞分化，倒置顯微鏡下觀察記錄其分化情況。利用細(xì)胞免疫熒光法對(duì)原代、傳代及單克隆神經(jīng)球行Nestin、Brdu檢測(cè)，鑒定神經(jīng)干細(xì)胞;對(duì)促分化后的細(xì)胞進(jìn)行GFAP、TUJ-1檢測(cè)，鑒定分化細(xì)胞的類型。
　　結(jié)果:腸神經(jīng)干細(xì)胞體外分離并培養(yǎng)至10天時(shí)出現(xiàn)神經(jīng)球，后神經(jīng)球逐漸增大，至15天左右至最大，神經(jīng)球消化成單細(xì)胞后可繼續(xù)傳代培養(yǎng)，最多能傳至6代?？寺〕汕?qū)嶒?yàn)顯示腸神經(jīng)干細(xì)胞可不斷增殖，形成神經(jīng)球。腸神

3、經(jīng)干細(xì)胞形成的神經(jīng)球經(jīng)細(xì)胞免疫熒光鑒定顯示Nestin、Brdu染色陽性，利用含10％胎牛血清的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)后可以獲得不同的細(xì)胞，其中部分細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞免疫熒光鑒定顯示GFAP染色陽性，部分顯示TUJ-1染色陽性。
　　結(jié)論:利用無血清培養(yǎng)技術(shù)成功從先天性巨結(jié)腸及腸閉鎖患兒手術(shù)切除腸管中分離培養(yǎng)出腸神經(jīng)干細(xì)胞，可在體外增殖并傳代培養(yǎng)，并通過單克隆培養(yǎng)獲得大量純化可作為細(xì)胞移植治療供體的腸神經(jīng)干細(xì)胞。所得神經(jīng)球強(qiáng)陽性表達(dá)Nestin、

4、Brdu，誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗原Tuj-1和GFAP，說明得到的神經(jīng)球有多項(xiàng)分化潛能。
　　第二部分:人源性腸神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的的方法學(xué)探究
　　目的:研究從先天性巨結(jié)腸及腸閉鎖患兒手術(shù)切除腸管中分離提取培養(yǎng)出腸神經(jīng)干細(xì)胞并在體外大量擴(kuò)增的方法，建立可靠穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步研究腸神經(jīng)干細(xì)胞移植治療先天性巨結(jié)腸癥提供可靠的細(xì)胞來源。
　　方法:在原代培養(yǎng)中，用三種不同的提取培養(yǎng)方案對(duì)手

5、術(shù)切下的腸管進(jìn)行消化，提取腸神經(jīng)干細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)結(jié)果;在傳代培養(yǎng)中，比較accutase酶消化傳代法與機(jī)械吹打傳代法對(duì)腸神經(jīng)干細(xì)胞傳代的影響;比較不同成分的培養(yǎng)基對(duì)體外培養(yǎng)的腸神經(jīng)干細(xì)胞增殖情況的影響。
　　結(jié)果:原代培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)方案三成功培養(yǎng)出腸神經(jīng)球，另兩種方案均培養(yǎng)失敗;在傳代培養(yǎng)時(shí)，accutase酶消化法比機(jī)械吹打法效率更高，消化后細(xì)胞活性更好;培養(yǎng)基Ⅰ和培養(yǎng)基Ⅱ?qū)ι窠?jīng)干細(xì)胞的增殖影響不大，統(tǒng)計(jì)學(xué)無明顯差異

6、。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)建立了人體成體腸神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系:在進(jìn)行人源性腸神經(jīng)干細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)時(shí)，采用膠原酶加中性蛋白酶效果更佳，傳代時(shí)，應(yīng)選用accutase酶消化法，培養(yǎng)基培養(yǎng)基Ⅰ和培養(yǎng)基Ⅱ均可用于腸神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)，但培養(yǎng)基Ⅰ成分明確，更適合科學(xué)研究。
　　第三部分:人源性腸神經(jīng)干細(xì)胞的生物學(xué)特性初探
　　目的:對(duì)體外培養(yǎng)的腸道神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性初步研究，了解其生物學(xué)特性，為將來的細(xì)胞移植治療先天性巨

7、結(jié)腸奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法:CCK-8法繪制神經(jīng)干細(xì)胞的生長曲線，分別于24h、48h、72h、96h、120h、144h六個(gè)時(shí)間點(diǎn)用酶標(biāo)儀測(cè)量腸神經(jīng)干細(xì)胞在450nm處的OD值;待神經(jīng)球形成，利用倒置相差顯微鏡觀察并記錄神經(jīng)球的直徑變化，以此比較先天性巨結(jié)腸來源的腸神經(jīng)干細(xì)胞不同代數(shù)之間及與腸閉鎖來源的腸神經(jīng)干細(xì)胞之間的增殖特性的差異;采用酶組織化學(xué)法觀察比較先天性巨結(jié)腸來源的腸神經(jīng)干細(xì)胞隨時(shí)間變化其氮能神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)元的

8、改變。采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法和細(xì)胞免疫熒光方法測(cè)量先天性巨結(jié)腸來源的腸神經(jīng)干細(xì)胞與目前公認(rèn)的和先天性巨結(jié)腸發(fā)病可能相關(guān)的3種突變基因即RET、GDNF、SOX10的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位情況。
　　結(jié)果:先天性巨結(jié)腸來源的腸神經(jīng)干細(xì)胞第三代和腸閉鎖來源的腸神經(jīng)干細(xì)胞第三代生長曲線近似，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯差異，且它們的生長曲線的高峰明顯比先天性巨結(jié)腸來源的腸神經(jīng)干細(xì)胞第四代提前;先天性巨結(jié)腸來源的腸神經(jīng)干細(xì)胞和腸閉鎖來源的腸神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)

9、形成的神經(jīng)球比它們傳代后形成的神經(jīng)球所需時(shí)間更短;先天性巨結(jié)腸來源的AchE酶組織化學(xué)檢測(cè)顯示原代細(xì)胞的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均光密度分別為0.26±0.03，0.31±0.01，0.27±0.02，三者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;NADPH-d酶組織化學(xué)檢測(cè)顯示原代細(xì)胞的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均光密度分別為0.13±0.03，0.26±0.04，0.27±0.02，前兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;細(xì)胞免疫熒光方法和免疫細(xì)胞化學(xué)方法顯示先天性巨結(jié)

10、腸來源的腸神經(jīng)干細(xì)胞原代和傳代細(xì)胞均有表達(dá)GDNF、RET和SOX10，其中SOX10主要表達(dá)于細(xì)胞核，RET和GDNF則表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。
　　結(jié)論:體外培養(yǎng)的先天性巨結(jié)腸來源的腸神經(jīng)干細(xì)胞和腸閉鎖來源的腸神經(jīng)干細(xì)胞在增殖特性上無顯著差異;體外培養(yǎng)的先天性巨結(jié)腸來源的腸神經(jīng)干細(xì)胞能分化成氮能神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)元，先天性巨結(jié)腸來源的腸神經(jīng)干細(xì)胞原代和傳代細(xì)胞均有表達(dá)RET GDNF和SOX10的能力，可以作為細(xì)胞移植的種子細(xì)