化療藥物富集小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1中腫瘤干細(xì)胞及其耐藥機(jī)制研究.pdf

1、目的:利用化療藥物富集小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1中腫瘤干細(xì)胞(cancerstem cell,CSC),研究腫瘤干細(xì)胞的一些耐藥機(jī)制,為進(jìn)一步探索乳腺癌干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制、開(kāi)發(fā)靶向乳腺癌干細(xì)胞的分子制劑奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:1化療藥富集乳腺癌干細(xì)胞動(dòng)物模型的建立。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期4T1細(xì)胞,接種于BALB/c小鼠右肩胛部皮下,建立小鼠乳腺癌模型。將小鼠隨機(jī)分為4組,分別為對(duì)照組和5-氟尿嘧啶(5-Fu)低、中、高濃度處理組。待小鼠成瘤

2、后,對(duì)照組給予生理鹽水,5-Fu處理組分別給予低、中、高濃度(0.05mg/ml、0.1 mg/ml、0.2mg/ml)5-Fu腹腔注射,每天一次,共用七天,七天后改為一周一次,四周后引頸處死小鼠,將腫瘤組織分為三份,一份以中性甲醛固定進(jìn)行免疫組化檢測(cè),一份用于RNA提取,一份制成細(xì)胞懸液用于流式檢測(cè)CD44+CD24-/low細(xì)胞比例和Hoechest33342染色檢測(cè)側(cè)群(side population,SP)細(xì)胞比例。取CD44+

3、CD24-/low細(xì)胞比例最高的5-Fu處理組小鼠腫瘤組織,制備細(xì)胞:懸液,建立第二代富集CSC的小鼠移植瘤模型,荷瘤小鼠用相同濃度5-Fu化療,用藥方法同前,如此傳代共制作四代小鼠移植瘤模型。
　　 2采用流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測(cè)各代對(duì)照組和5-Fu處理組小鼠移植瘤模型腫瘤組織中CD44+CD24-/low細(xì)胞的比例。
　　 3采用Hoechst33342染色法檢測(cè)各代對(duì)照組和5-Fu處

4、理組小鼠移植瘤模型腫瘤組織中SP細(xì)胞比例。
　　 4免疫組化法檢測(cè)各代對(duì)照組和5-Fu處理組小鼠移植瘤模型腫瘤組織中CD55和ALDH1蛋白的表達(dá)。
　　 5觀察無(wú)血清培養(yǎng)各代對(duì)照組和5-Fu處理組小鼠移植瘤組織細(xì)胞微球體的形成,計(jì)數(shù)微球體的數(shù)目并計(jì)算微球體的形成效率。
　　 6觀察第三代5-Fu處理組小鼠移植瘤細(xì)胞形成的微球體在有血清培養(yǎng)環(huán)境下的誘導(dǎo)分化。
　　 7動(dòng)物致瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)第三代對(duì)照組和5-Fu

5、處理組小鼠移植瘤細(xì)胞的致瘤能力。
　　 8經(jīng)HE染色,光鏡下觀察小鼠移植瘤模型腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化。
　　 9采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription PCR,RT-PCR)半定量和實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)檢測(cè)第三代對(duì)照組和5-Fu處理組小鼠移植瘤組織中MDR1、BCRP、ALDH1和β-catenin mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:1利用化療藥5-Fu誘導(dǎo)下4T

6、1細(xì)胞系在小鼠體內(nèi)傳代的方法,建立了富集乳腺癌干細(xì)胞的小鼠移植瘤模型,將從5-Fu處理組第一、二、三、四代小鼠模型腫瘤組織中分離所得細(xì)胞分別命名為4T1-lst、4T1-2nd、4T1-3rd、4T1-4th細(xì)胞,而對(duì)照組小鼠腫瘤組織分離所得細(xì)胞命名為parental4T1細(xì)胞。
　　 2 FCM檢測(cè)結(jié)果顯示,第一代對(duì)照組小鼠移植瘤組織中CD44+CD24-low細(xì)胞比例為11.5±0.9％,低、中、高濃度5-Fu處理后其比例分

7、別為40.1±3.4％、49.8±1.2％、45.64±1.6％,明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。中、高濃度組明顯高于低濃度組(P<0.05),而中、高濃度組之間無(wú)明顯差異(P>0.05)。中濃度5-Fu處理后小鼠移植瘤組織中CD44+CD24-low細(xì)胞比例高于其它兩組,所以選擇中濃度(0.1mg/ml)5-Fu進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。5-Fu處理組第一、二、三、四代小鼠移植瘤組織中CD44+CD24-/low細(xì)胞比例分別為49.8±1.26

8、％、56.8±1.76％、66.4±1.5％、69.0±1.6％,顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。隨著傳代次數(shù)的增加,CD44+CD24-/low細(xì)胞比例逐漸升高,除第三、四代之間差異不明顯(P>0.05)外,其他各代之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3 Hoechst33342染色結(jié)果顯示,5-Fu處理組第一、二、三、四代小鼠移植瘤組織中SP細(xì)胞比例分別為25.0±1.21％、42.6±2.8％、58.4±2.2

9、％、61.3±2.6％,顯著高于對(duì)照組的9.7±1.4％(P<0.01)。隨著傳代次數(shù)的增加,SP細(xì)胞比例逐漸升高,除第三、四代之間差異不明顯(P>0.05)外,其他各代之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4免疫組化結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠移植瘤組織中ALDH1表達(dá)為陰性,5-Fu處理組第一、二、三、四代小鼠移植瘤組織ALDH1表達(dá)為弱陽(yáng)性到陽(yáng)性,隨著傳代次數(shù)的增加5-Fu處理組ALDH1表達(dá)水平逐漸升高。5-Fu處理組

10、第一、二、三、四代小鼠移植瘤組織中CD55強(qiáng)表達(dá)細(xì)胞數(shù)分別為7.8±1.6％、10.1±2.0％、15.6±1.4％、17.3±1.9％,明顯高于對(duì)照組的0.6±0.3％(P<0.01),且隨著傳代次數(shù)的增加5-Fu處理組CD55表達(dá)水平逐漸升高。
　　 5無(wú)血清培養(yǎng)小鼠移植瘤細(xì)胞結(jié)果顯示,4T1-3rd細(xì)胞微球體形成效率為5.9±0.4％,parental4T1細(xì)胞微球體形成效率為0.5±0.2％,前者約是后者的12倍(P<0

11、.01)；4T1-3rd細(xì)胞形成的第一代微球體可以傳代形成相同比例的第二、三代微球體且可傳至5代,而parental4T1細(xì)胞形成的微球體只傳至3代后就不再形成細(xì)胞球,開(kāi)始黏附、分化。4T1-4th細(xì)胞微球體形成效率為6.1±0.3％,與4T1-3rd.細(xì)胞之間無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　 6有血清培養(yǎng)微球體的誘導(dǎo)分化結(jié)果顯示,4T1-3rd微球體細(xì)胞可在有血清培養(yǎng)基中逐漸貼壁分化,并且可以連續(xù)傳代。
　　 7動(dòng)物

12、致瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,4T1-3rd細(xì)胞的致瘤能力明顯高于parental4T1細(xì)胞。
　　 8經(jīng)HE染色光鏡下觀察結(jié)果顯示,所有荷瘤小鼠的移植瘤組織均為乳腺癌組織,接種4T1-3rd細(xì)胞和。parental4T1細(xì)胞的小鼠腫瘤組織在形態(tài)學(xué)上無(wú)明顯差異。
　　 9半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,第三代5-Fu處理組小鼠移植瘤組織中MDR1、BCRP、ALDH1mRNA表達(dá)水平升高,與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01

13、),而β-catenin mRNA的表達(dá)水平在兩組之間未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)。
　　 Rt-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,5-Fu處理組小鼠移植瘤組織中MDR1、BCRP和ALDH1mRNA的表達(dá)較對(duì)照組分別上調(diào)了4.35、6.14、3.78倍,二者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；β-catenin mRNA的表達(dá)上調(diào)了1.75倍,二者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論:1利用化療藥5-Fu富集的乳

14、腺癌干細(xì)胞建立了荷瘤小鼠動(dòng)物模型,經(jīng)在小鼠體內(nèi)傳代產(chǎn)生了高度惡性的小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1-3rd,4T1-3rd細(xì)胞中富集了高純度的CSC,提示應(yīng)用化療藥是篩選乳腺癌干細(xì)胞的有效方法。
　　 2第三代5-Fu處理組小鼠移植瘤組織高表達(dá)MDR1和BCRP,說(shuō)明乳腺癌干細(xì)胞可能通過(guò)MDR1和BCRP表達(dá)上調(diào)產(chǎn)生對(duì)化療藥物的抵抗性,逃逸化療藥物的攻擊。
　　 3第三代5-Fu處理組小鼠移植瘤組織中β-catenin表達(dá)水平升高,