腫瘤抗原MAGE-A4在乳腺癌組織和細胞系中的表達及功能研究.pdf

1、目前以腫瘤免疫治療為代表的腫瘤生物治療已經(jīng)成為繼手術(shù)、化療和放療之后的第四種腫瘤治療模式，研究和開發(fā)新型腫瘤疫苗已經(jīng)成為近年國際上腫瘤免疫治療的熱點之一。在目前已知的眾多腫瘤相關(guān)抗原中，癌睪丸抗原（CTA）有其特異的表達模式，即在各種腫瘤組織中有不同頻率的表達，而在正常組織中僅在睪丸生殖細胞中表達，偶然在胎盤中表達。但睪丸是免疫豁免器官，不引起機體特異性免疫反應(yīng)。因此，CTA適于作為特異性腫瘤免疫治療的靶抗原。
　　 作為CTA

2、亞家族的黑色素瘤抗原基因（MAGE）是從黑色素瘤細胞中分離出來的一大家族抗原基因，其編碼的腫瘤排斥抗原在細胞內(nèi)經(jīng)加工產(chǎn)生抗原肽，并與HLA-Ⅰ類分子結(jié)合形成復合物，能夠被自體細胞毒性T細胞識別，誘導出對相應(yīng)腫瘤細胞的特異性殺傷。MAGE基因在許多腫瘤組織中有較高的表達，但在正常組織（除睪丸和胚胎外）均不表達，因此可作為CTL介導腫瘤特異性免疫治療的理想靶分子。深入研究MAGE基因的功能將會為開展腫瘤分子學診斷和腫瘤免疫治療的臨床應(yīng)用奠定

3、良好的基礎(chǔ)。
　　 有研究提示，MAGE-A4可能表現(xiàn)了與該家族中其它成員不同的分子生物學特性，但是其具體的生物學功能和分子機制到目前還不十分清楚。本研究采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測了MAGE-A4 mRNA在77例乳腺癌良惡性組織及乳腺癌細胞系中的表達；構(gòu)建了同時表達MAGE-A4和FLAG標簽的表達載體FLAG-pcDNA3-MAGE-A4，并通過MTT分析和克隆形成實驗研究了MAGE-A4過表達對MAGE-A

4、4低表達的乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響；采用熒光素酶報告基因分析、RT-PCR、Western-blot、克隆形成實驗和TUNEL染色法檢測了MAGE-A4對p53轉(zhuǎn)錄活性的影響；采用細胞質(zhì)與細胞核分離實驗檢測了MAGE-A4在細胞中的定位；采用免疫熒光染色技術(shù)檢測了MAGE-A4與p73蛋白在細胞中的共定位；采用免疫共沉淀技術(shù)檢測了MAGE-A4與p53家族成員之間的物理性結(jié)合；利用siRNA技術(shù)研究了抑制MAGE-A4基因?qū)Ω弑磉_MA

5、GE-A4的乳腺癌細胞系凋亡的影響。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 第一部分：腫瘤抗原MAGE-A4在乳腺癌組織和細胞系中的表達
　　 目的：通過檢測MAGE-A4在乳腺正常組織、癌旁組織和癌組織及六種乳腺癌細胞系中的表達，探討其表達與乳腺癌臨床指標及生物學行為的關(guān)系
　　 方法：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)從轉(zhuǎn)錄水平上檢測MAGE-A4在乳腺正常組織、癌旁組織和癌組織及六種乳腺癌細胞系中的表達，并

6、回顧性分析其表達與乳腺癌臨床指標與生物學行為（包括患者年齡、腫瘤大小、TNM分期、病理類型、組織學分級、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、有否脈管瘤栓、ER/PR和HER-2表達）的關(guān)系。
　　 結(jié)論：
　　 1.正常乳腺組織中無MAGE-A4 mRNA表達；乳腺癌旁組織中MAGE-A4 mRNA表達陽性率為5.19％；乳腺癌組織中MAGE-A4 mRNA表達陽性率為42.9％。提示MAGE-A4可作為腫瘤特異性抗原。
　　 2

7、.MAGE-A4 mRNA表達與乳腺癌患者的腫瘤大小、臨床分期、病理類型、組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管瘤栓、ER/PR及HER-2狀態(tài)無明顯相關(guān)性,但與患者的年齡存在明顯的相關(guān)性。60歲以上乳腺癌患者腫瘤組織中MAGE-A4mRNA表達陽性率明顯高于60歲以下乳腺癌患者。
　　 3.六種乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-157、MDA-MB-453和MDA-MB-468中均無MAGE-A4 mRNA表達

8、；MDA-MB-436中MAGE-A4 mRNA呈高表達。
　　 第二部分：FLAG-pcDNA3-MAGE-A4表達載體的構(gòu)建及功能分析
　　 目的：構(gòu)建帶有FLAG標簽的MAGE-A4基因表達載體，并研究其對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響。
　　 方法：利用巢式PCR及基因重組技術(shù)構(gòu)建帶有FLAG標簽的MAGE-A4基因表達載體FLAG-pcDNA3-MAGE-A4，并通過克隆形成實驗和MTT法研究MAGE-A4

9、過表達對MAGE-A4低表達的乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建了MAGE-A4基因表達載體FLAG-pcDNA3-MAGE-A4，并且構(gòu)建好的載體在體外表達陽性。
　　 2.外源性MAGE-A4可以抑制MCF-7和MDA-MB-231細胞的增殖。
　　 3.外源性MAGE-A4增加了阿霉素誘導的MCF-7細胞的死亡率；但對MDA-MB-231細胞沒有顯著影響。
　　

10、第三部分：MAGE-A4與p53家族之間關(guān)系的研究
　　 目的：研究MAGE-A4對p53轉(zhuǎn)錄活性的影響，MAGE-A4是否與p53家族成員之間存在直接的物理結(jié)合，進而證實MAGE-A4的功能發(fā)揮是否部分或全部通過p53通路而完成。
　　 方法：采用熒光素酶報告基因分析、RT-PCR、Western-blot、克隆形成實驗和TUNEL染色法檢測MAGE-A4對p53轉(zhuǎn)錄活性的影響；采用細胞質(zhì)與細胞核分離實驗檢測MAGE-

11、A4在細胞中的定位；采用免疫熒光染色技術(shù)檢測MAGE-A4與p73蛋白在細胞中的共定位；采用免疫共沉淀技術(shù)檢測MAGE-A4與p53家族成員之間的物理性結(jié)合。
　　 結(jié)論：
　　 1.MAGE-A4可以增加p53的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 2.MAGE-A4可以通過增加p53轉(zhuǎn)錄活性而產(chǎn)生抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡的功能。
　　 3.MAGE-A4在細胞質(zhì)和細胞核中均有表達。
　　 4.p73和MAGE-

12、A4在細胞核中存在共定位。
　　 5.p53和MAGE-A4蛋白之間以及p73和MAGE-A4蛋白之間均存在物理性結(jié)合。MAGE-A4蛋白通過和p53家族成員之間的直接結(jié)合而發(fā)揮生物學功能。
　　 第四部分：MAGE-A4siRNA對乳腺癌細胞MDA-MB-436凋亡的影響
　　 目的：檢測靶向MAGE-A4 siRNA對乳腺癌細胞MDA-MB-436凋亡的影響。
　　 方法：采用MAGE-A4 siRN

13、A轉(zhuǎn)染抑制乳腺癌細胞MDA-MB-436中MAGE-A4的表達，然后使用順鉑誘導細胞凋亡，利用TUNEL染色法、流式細胞分析技術(shù)及檢測PARP蛋白裂解來分析MAGE-A4 siRNA對乳腺癌細胞MDA-MB-436凋亡的影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.靶向MAGE-A4 siRNA轉(zhuǎn)染對MDA-MB-436細胞MAGE-A4表達有明顯的抑制效果。
　　 2.MDA-MB-436對阿霉素耐藥，而對順鉑較敏感。