鞭毛蛋白在重組減毒鼠傷寒沙門菌誘導(dǎo)固有免疫應(yīng)答中的作用研究.pdf

1、細(xì)菌鞭毛蛋白可誘導(dǎo)宿主固有免疫應(yīng)答的產(chǎn)生,但是鞭毛蛋白在重組減毒沙門菌固有免疫應(yīng)答中作用的研究鮮見。本研究旨在探討鞭毛蛋白在減毒鼠傷寒沙門菌對(duì)家禽和小鼠固有免疫誘導(dǎo)中的作用,進(jìn)而為篩選合適的減毒沙門菌作為疫苗載體提供理論依據(jù)。
　　 根據(jù)雞IL-6、IL-1β、IFN-γ、TGF-β4、β-actin mRNA的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物,提取經(jīng)鞭毛蛋白刺激的雞巨噬細(xì)胞HD11總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR(r

2、eal-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)方法。通過熔解曲線及擴(kuò)增曲線的分析表明,本研究所建立的qRT-PCR方法特異性強(qiáng)、重復(fù)性好。HD11細(xì)胞經(jīng)鞭毛蛋白刺激后,前炎性細(xì)胞因子IL-6和IL-1β的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著升高(P＜0.05);而IFN-γ與抗炎性細(xì)胞因子TGF-β4的相對(duì)表達(dá)量無顯著變化(P＞0.05)。接著分離1周齡非免疫雞血液中的異嗜性白細(xì)胞,用鞭毛蛋白、減毒

3、鼠傷寒沙門菌X4550(pYA3334-F)及其鞭毛蛋白缺失株X4550△FlhD(pYA3334-F)進(jìn)行體外刺激,應(yīng)用qRT-PCR方法檢測刺激不同時(shí)間后這些細(xì)胞因子的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,鞭毛蛋白能顯著誘導(dǎo)異嗜白細(xì)胞中前炎性細(xì)胞因子IL-6和IL-1β的產(chǎn)生,TGF-β4的相對(duì)表達(dá)量無明顯變化(P＞0.05)。兩株細(xì)菌刺激2、3、4 h后異嗜白細(xì)胞均能上調(diào)IL-6和IL-1β的表達(dá),TGF-β4在刺激4 h后表達(dá)顯著上調(diào),IFN-γ

4、在檢測的時(shí)間點(diǎn)均未出現(xiàn)擴(kuò)增。鼠傷寒沙門菌X4550(pYA3334-F)與異嗜白細(xì)胞作用3 h和4 h后對(duì)IL-6、IL-1β和TGF-β4的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)能力要顯著高于X4550△FlhD(pYA3334-F)。
　　 以5×109劑量的X4550(pYA3334-F)和X4550△FlhD(pYA3334-F)分別口服感染1周齡非免疫雞,在感染后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)兩組雞的盲腸、肝臟、脾臟進(jìn)行細(xì)菌涂板計(jì)數(shù),并以qRT-PCR方法比較兩株細(xì)

5、菌早期感染(1、3、5 d)后血液異嗜白細(xì)胞、盲腸、脾臟中CXCLi2、IL-1β、TGF-β4以及TLR5的轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異。結(jié)果表明感染早期X4550△FlhD(pYA3334-F)在雞體內(nèi)定植能力要高于X4550(pYA3334-F),但是其體內(nèi)定植時(shí)間要短于X4550(pYA3334-F)。與X4550△FlhD(pYA3334-F)組相比,X4550(pYA3334-F)在感染3 d后,誘導(dǎo)雞體內(nèi)異嗜白細(xì)胞的炎癥反應(yīng),產(chǎn)生較多的C

6、XCLi2、IL-1β、TGF-β4和TLR-5以控制X4550(pYA3334-F)的早期感染數(shù)量。X4550(pYA3334-F)在感染早期能誘導(dǎo)雞盲腸和脾臟產(chǎn)生CXCLi2(1 d、3 d),IL-1β(3 d,5 d),TGF-β4(1 d)以及TLR5(1 d、3 d),且與X4550△FlhD(pYA3334-F)組存在顯著差異(P＜0.05)。
　　 以109劑量的X4550(pYA3334-F)和X4550△Fl

7、hD(pYA3334-F)分別口服感染6-8周齡BALB/c小鼠,在感染不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)兩組小鼠的派伊爾氏結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟進(jìn)行細(xì)菌涂板計(jì)數(shù),并比較兩株細(xì)菌早期感染(8 h、1d、3 d)后小腸、脾臟中MIP-2,MCP-1,IL-1β,IFN-γ,TNF-α,TGF-β,IL4等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異。結(jié)果表明X4550△FlhD(pYA3334-F)在感染早期的體內(nèi)定植能力高于X4550(pYA3334-F)。X4550(pY

8、A3334-F)在感染早期(8 h、1 d)誘導(dǎo)產(chǎn)生的MIP-2、MCP-1及IL-1β的表達(dá)水平要顯著高于X4550△FlhD(pYA3334-F)組(P＜0.05),其中X4550(pYA3334-F)感染組脾臟中TNF-α的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著高于X4550△FlhD(pYA3334-F)組,但在小腸中均未出現(xiàn)顯著上調(diào)。IFN-γ,在兩株細(xì)菌感染1 d小腸中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平出現(xiàn)顯著差異,但在脾臟中未出現(xiàn)顯著上調(diào)。早期感染后小腸和脾臟中I