趨化因子結(jié)合蛋白D6在乳腺癌中的表達(dá)及作用.pdf

1、目的：研究cc趨化因子結(jié)合蛋白D6在人乳腺癌中的組成性、誘導(dǎo)性表達(dá)，探索D6對乳腺癌細(xì)胞成瘤性和轉(zhuǎn)移的影響及其作用機制。 方法：采用RT-PCR方法檢測D6 mRNh在9種不同的人乳腺癌細(xì)胞系、乳腺癌組織、正常乳腺上皮細(xì)胞、正常乳腺組織以及人正常脾組織中的表達(dá)，并用實時熒光定量PCR進(jìn)一步驗證其在細(xì)胞中表達(dá)的差異；用重組人細(xì)胞因子IL-1β(0.5，1，2ng/ml)、TNF-α(10，20，40ng/ml)、IFN-γ(10，

2、20，40ng/ml)刺激MDA-MB-231細(xì)胞24h，實時熒光定量PCR分析D6基因表達(dá)的改變。選用MDA-MB-435細(xì)胞，轉(zhuǎn)染并挑選出D6穩(wěn)定過表達(dá)的細(xì)胞克隆MCA-MB-435/D6。體外實驗中，觀察D6過表達(dá)對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響；ELISA方法檢測細(xì)胞上清中D6配體濃度的變化。體內(nèi)實驗中，建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型，觀察移植瘤生長曲線和肺轉(zhuǎn)移灶，免疫組化方法檢測原發(fā)灶中D6的表達(dá)情況、標(biāo)記移植瘤內(nèi)新生血管(抗-CD34

3、)，ELISA法檢測原發(fā)灶和裸鼠血清中CCL2和CCL5的改變。隨機挑選復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2004～2007年間乳腺癌臨床組織標(biāo)本72例及正常組織32例(平均年齡52.42±12.53)，通過實時熒光定量PCR法檢測D6 mRNA表達(dá)，結(jié)果數(shù)據(jù)用student-t檢驗分析，對D6的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、ER、PR、Her2狀態(tài)的相關(guān)性進(jìn)行分析。 結(jié)果：D6 mRNA在所有9種人乳腺癌細(xì)胞系、乳腺癌組織、正常乳腺上皮細(xì)胞、

4、正常乳腺組織以及作為陽性對照的人正常脾組織均有表達(dá)，并且在不同的乳腺癌細(xì)胞中其表達(dá)水平存在差異；細(xì)胞因子IL-1β可呈劑量依賴性地促進(jìn)D6的表達(dá)，TNF-α則抑制其表達(dá)，而IFN-γ對D6 mRNh的表達(dá)則沒有明顯影響。成功篩選D6過表達(dá)的MDA-MB-435/D6細(xì)胞株。體外實驗中，轉(zhuǎn)染了D6質(zhì)粒后的MDA-MB-435/D6細(xì)胞生長受抑制，侵襲能力明顯減弱，細(xì)胞周期分布也發(fā)生改變，細(xì)胞培養(yǎng)上清中幾乎所有的D6配體趨化因子的濃度都降低

5、，尤以CCL2(MCP-1)和CCL4(MIP-1β)和CCL13(MCP-4)下降最為明顯。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，D6轉(zhuǎn)染組移植瘤出現(xiàn)的時間晚于對照組，生長速度減慢，移植瘤體積明顯縮小；肺內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù)目也顯著減少；同時無論是在瘤體內(nèi)還是在裸鼠血清中D6配體趨化因子CCL2和CCL5(NTES)都降低，瘤體內(nèi)新生微血管也明顯減少。人乳腺癌臨床組織標(biāo)本分析結(jié)果顯示，D6 mRNA的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈負(fù)相關(guān)，而與ER、PR及Her2則

6、沒有明顯的相關(guān)性。此外，雖然與癌組織相比，癌旁乳腺組織的D6基因表達(dá)水平略高，但其差異沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性意義。 結(jié)論：cc族趨化因子結(jié)合蛋白D6在乳腺癌細(xì)胞、乳腺癌組織、正常乳腺上皮細(xì)胞及正常乳腺組織均呈組成性表達(dá)。D6 mRNA的表達(dá)至少部分地受細(xì)胞因子調(diào)節(jié)。乳腺癌患者臨床標(biāo)本中D6的表達(dá)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移和臨床分期呈負(fù)相關(guān)。本研究首次從mRNA和蛋白質(zhì)水平上證實人乳腺癌細(xì)胞可產(chǎn)生D6，體內(nèi)體外研究的結(jié)果均提示D6分子可能主要通