番茄抗葉霉菌相關(guān)基因的鑒定及TRV 16K基因的功能分析.pdf

1、基因?qū)蚩剐允侵参锟共⌒缘闹匾憩F(xiàn)形式。番茄(Lycopersicon esculentum)與葉霉菌(Cladosporium fulvum)系統(tǒng)是研究基因?qū)蚩剐缘哪Ｊ较到y(tǒng)。番茄抗病基因Cf和互補(bǔ)的葉霉菌無(wú)毒基因Avr進(jìn)行識(shí)別互作，激活下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑，活化防衛(wèi)反應(yīng)，導(dǎo)致番茄對(duì)葉霉菌抗性的產(chǎn)生，關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)基因的分離和功能分析將增進(jìn)對(duì)番茄對(duì)葉霉菌抗性機(jī)理的理解。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus induced genesilenc

2、ing，VIGS)是近年發(fā)展起來(lái)的一種研究植物基因功能的強(qiáng)有力工具，已被廣泛應(yīng)用于植物抗病性、生長(zhǎng)發(fā)育及代謝調(diào)控相關(guān)基因的功能研究。由煙草脆裂病毒(Tobacco ratde virus，TRV)改造成的載體是目前利用最廣泛的VIGS載體。pTRV1中16K ORF在TRV介導(dǎo)的基因沉默中的作用尚不明確。 本論文研究?jī)?nèi)容包括兩部分。第一部分，從本實(shí)驗(yàn)室已克隆的ACE(Avr/Cfelicited)基因片段，即Cf/Avr介導(dǎo)產(chǎn)生

3、過(guò)敏性反應(yīng)時(shí)特異表達(dá)的cDNA-AFLP片段，中挑選6個(gè)具代表性的片段，采用VIGS技術(shù)鑒定這些片段對(duì)應(yīng)基因在Cf-4/Avr介導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)敏性反應(yīng)中的作用，篩選獲取可能起重要作用的基因。第二部分，構(gòu)建缺失16K ORF的pTRV1表達(dá)結(jié)構(gòu)，將缺失型TRV與野生型TRV誘導(dǎo)基因沉默效果進(jìn)行比較分析，明確pTRVl的16K ORF在基因沉默中的作用。所獲主要結(jié)果如下： 1、初步明確了6個(gè)ACE片段相應(yīng)基因在Cf-4/Avr4介導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)

4、敏性反應(yīng)中的作用。根據(jù)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已克隆的182個(gè)ACE片段進(jìn)行的生物信息學(xué)基因功能預(yù)測(cè)結(jié)果，挑選其中6個(gè)，即ACE片段5、14、39、85、95和111，供基因沉默分析。ACE5和ACE95片段相應(yīng)基因功能未知，ACE14、ACE39、ACE85、ACE111片段分別與鈣依賴蛋白磷酸酶(Calcineurin)、40S核糖體蛋白S13、含LRR蛋白激酶、HR指示蛋白HSR203J有顯著序列同源性。構(gòu)建了插入這些片段供VIGS分析用的重組

5、質(zhì)粒。進(jìn)行了TRV介導(dǎo)的VIGS分析和Cf-4/Avr4介導(dǎo)的HR檢驗(yàn)。結(jié)果表明，ACE14、ACE85、ACE111基因的沉默抑制植株生長(zhǎng)，導(dǎo)致葉片畸形，因此這些基因可能與植株生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)：ACE95基因的沉默顯著抑制Cf-4/Avr4介導(dǎo)的HR的產(chǎn)生，說(shuō)NACE95相應(yīng)基因可能在番茄抗葉霉病中起重要作用。 2、明確了pTRV1中16K ORF對(duì)TIV介導(dǎo)基因沉默的影響。利用Spe I和Stu I構(gòu)建了缺失16K ORF的pT

6、RV1表達(dá)結(jié)構(gòu)。比較分析了野生型TRv和缺失16K ORF的TRV載體介導(dǎo)的基因沉默效率。結(jié)果表明，在本氏煙中，缺失型TRv介導(dǎo)的基因沉默比野生型TRV更完全，基因完全沉默的植株百分率比野生型TRV增加了16％。在三生煙中，無(wú)論野生型還是缺失型TRV介導(dǎo)產(chǎn)生的基因沉默效率均很低，缺失型TRv介導(dǎo)產(chǎn)生的基因沉默效率相對(duì)更高。此外，轉(zhuǎn)化缺失型TRv結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌接種后，植株接種葉和上部非接種葉中TRV的積累量均顯著低于野生型結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化菌接種植株