HO-1系統(tǒng)對小鼠免疫細胞功能的影響.pdf

1、本文主要從以下幾方面展開論述：
　　第一部分
　　目的：研究小鼠骨髓來源樹突狀細胞及淋巴細胞各亞群的HO-1表達，并研究HO-1特異性誘導劑對不同成熟度樹突狀細胞的效應。
　　方法：分離培養(yǎng)小鼠骨髓來源樹突狀細胞；流式細胞術比較懸浮樹突狀細胞及貼壁樹突狀細胞表型差異以及HO-1表達水平差異；分別使用50uM CoPP和SnPP與貼壁未成熟樹突狀細胞共同孵育2h，采免疫印跡法和流式細胞術比較上述幾群細胞HO-1表達水平差

2、異；LPS刺激細胞成熟，隨后加入CoPP孵育，流式細胞術檢測CoPP孵育前后細胞表型及HO-1表達水平差異；磁珠分選CD4+細胞，使用CD3/CD28刺激2d為效應T細胞，磁珠分選CD4+CD25-T淋巴細胞及CD4+CD25+T淋巴細胞，流式細胞術分別檢測CD4+CD25-T淋巴細胞及CD4+CD25+T淋巴細胞、CD4+效應T細胞、CD8+T淋巴細胞和CD19+B淋巴細胞HO-1表達水平。
　　結果：貼壁樹突狀細胞共刺激分子表

3、達較低，HO-1表達更高（平均熒光強度41.4 Vs.26.5）；CoPP可以誘導未成熟樹突狀細胞高表達 HO-1(P<0.05)，但是對成熟 DC沒有影響；CD4+CD25+Treg及激活后的CD4+T細胞均表達HO-1，而在CD8+T淋巴細胞和CD19+B淋巴細胞中幾乎不表達。
　　結論：CoPP可以增加未成熟樹突狀細胞HO-1表達，但不能增加成熟樹突狀細胞HO-1的表達。HO-1在調節(jié)性T細胞和活化后的效應細胞中表達。

4、>　　第二部分
　　目的：研究HO-1對小鼠未成熟樹突狀的成熟能、免疫調節(jié)能力及誘導調節(jié)性T細胞的能力的影響。
　　方法：流式細胞術檢測 CoPP或SnPP孵育未成熟貼壁樹突狀細胞后表型及刺激同種異體淋巴細胞增殖能力的變化；流式細胞術檢測LPS刺激CoPP孵育后的樹突狀細胞的表型變化；流式細胞術檢測CoPP或SnPP孵育后貼壁樹突狀細胞對CD3/CD28刺激的淋巴細胞增殖的抑制能力變化，并使用 Transwell判斷樹突狀細

5、胞的抑制能力是否依賴細胞接觸。流式細胞術檢測CoPP或SnPP孵育后貼壁DC對Treg誘導能力的變化。
　　結果：CoPP或SnPP孵育未成熟樹突狀細胞后低表達MHCII/CD80/CD86,刺激同種異體淋巴細胞增殖能力均很弱。CoPP處理后的未成熟樹突狀細胞經 LPS刺激后，MHCII/CD80與MHCII/CD86雙陽性細胞分別為20.09％和10.15％，而未經CoPP處理的樹突狀細胞經 LPS刺激后，MHCII/CD80與

6、 MHCII/CD86雙陽性細胞分別為45.47％和31.59％。抗小鼠CD3/CD28抗體可明顯刺激淋巴細胞增殖，其中CD4+細胞增殖85.3％，CD8+細胞增殖81.5％。加入未成熟樹突狀細胞后可明顯抑制淋巴細胞增殖，且隨抑制細胞與反應細胞比例下降，其抑制能力隨之減弱。在抑制細胞與反應細胞比例為1:16時，未處理組、CoPP處理組、SnPP處理組中CD4+細胞增殖比例分別為48.1％、31.6％和61.6％，CD8+細胞增殖比例分別

7、為57.8％、38.9％和70.5％。加入Transwell后，樹突狀細胞抑制能力消失。CoPP處理組樹突狀細胞與未處理組誘導調節(jié)性T細胞能力接近，分別為20％和22％，但是SnPP處理組誘導調節(jié)性T細胞能力下降，比例僅為12％。
　　結論：誘導未成熟樹突狀細胞高表達HO-1可增強其抵御成熟的能力及抑制T細胞增殖的能力。樹突狀細胞抑制增殖的能力依賴于細胞接觸。抑制未成熟樹突狀細胞 HO-1活性可抑制其誘導調節(jié)性T細胞的能力。

8、>　　第三部分
　　目的：研究一氧化碳對淋巴細胞增殖的影響。
　　方法：將100uM一氧化碳釋放分子（CORM-2）與未分選淋巴細胞、磁珠分選 CD4+淋巴細胞和磁珠分選CD4+CD25-細胞孵育，隨后用抗小鼠CD3/CD28抗體刺激淋巴細胞增殖，2至3天后采用流式細胞術檢測淋巴細胞增殖情況。
　　結果：根據淋巴細胞干預方式分為：空白對照組，iCORM-2對照組及CORM-2實驗組。反應細胞為淋巴結淋巴細胞時，與100

9、uM CORM-2共同孵育后，在CD3/CD28的刺激作用下基本不增殖。而兩對照組淋巴細胞在CD3/CD28刺激3天后CD4+淋巴細胞與CD8+淋巴細胞均增殖85％以上。反應細胞為分選后CD4+淋巴細胞時，在CD3/CD28的刺激2天后，實驗組有35％的CD4+淋巴細胞增殖，對照組達到70％左右。當CD3/CD28刺激3天后，CD4+淋巴細胞增殖細胞比例進一步增加，達到57％，兩個對照組細胞比例大于65％。反應細胞為分選后 CD4+CD

10、25-淋巴細胞時，在CD3/CD28的刺激2天后增殖較少，實驗組有23％的CD4+淋巴細胞增殖。而iCORM-2組與未處理組淋巴細胞增殖均達到35％以上。當CD3/CD28刺激3天后，CD4+CD25-淋巴細胞增殖細胞比例為10％，兩個對照組細胞比例約為50％。
　　結論：CO對CD3/CD28刺激的未分選淋巴細胞、分選后 CD4+淋巴細胞及分選后CD4+CD25-淋巴細胞增殖均有顯著抑制效應。
　　第四部分
　　目的

11、：研究CO對小鼠未成熟樹突狀成熟能力及免疫調節(jié)能力的影響。
　　方法：流式細胞術檢測CORM-2或iCORM-2孵育未成熟貼壁樹突狀細胞后表型變化；流式細胞術檢測LPS刺激CORM-2或iCORM-2孵育樹突狀后表型變化；流式細胞術檢測CORM-2或iCORM-2孵育后貼壁樹突狀細胞對CD3/CD28刺激的淋巴細胞增殖的抑制能力變化。
　　結果：經過iCORM-2或CORM-2處理后的貼壁樹突狀細胞共刺激分子表達均無明顯變化

12、，MHC/CD40、MHCII/CD80與 MHCII/CD86雙陽性細胞比例均在2％以下。CORM-2處理后的未成熟樹突狀細胞經 LPS刺激后，MHC/CD40、MHCII/CD80與MHCII/CD86雙陽性細胞分別為19.8％、0.4％、8.88％。而無任何預處理的未成熟樹突狀細胞LPS刺激后MHCII/CD40、MHCII/CD80、MHCII/CD86雙陽性的細胞可達34.3％、26.2％和36.1％。預先給予iCORM-2再

13、使用LPS刺激的樹突狀細胞各項指標與成熟樹突狀細胞相似，雙性細胞比例分別40.5％、27.8％和38.3％。CD3/CD28可以刺激T細胞活化，共同培養(yǎng)三天后，CD4+細胞與CD8+細胞分別增殖81％和78.1％。加入未成熟樹突狀細胞后增殖能力大大降低。當抑制細胞與反應細胞比例為1:4時，各組抑制效應最強，其中空白對照組貼壁未成熟樹突狀細胞、iCORM-2對照組、CORM-2實驗組CD4+細胞增殖比例分別為33.9％，45.2％和51.