β1,3-N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(β3Gn-T8)對(duì)人腦星形膠質(zhì)瘤侵襲和增殖的影響.pdf

1、本研究旨在探討β1，3-N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶8(β3Gn-T8)對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲及增殖的影響。通過(guò)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性表型相關(guān)因子、成瘤模型及臨床標(biāo)本的相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)分析，來(lái)了解β3Gn-T8在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演的重要作用，為治療人惡性膠質(zhì)瘤提供一個(gè)新的有效的輔助分子治療方法。
　　 目的:
　　 (1)探討糖基轉(zhuǎn)移酶β3Gn-T8在人腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織中表達(dá)的差異。
　　 (2)在人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞水平

2、探討糖基轉(zhuǎn)移酶β3Gn-T8對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲及增殖能力的影響，以及β3Gn-T8與MMP-2的關(guān)系。
　　 (3)觀察糖基轉(zhuǎn)移酶β3Gn-T8對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤生長(zhǎng)的影響。
　　 (4)探討糖基轉(zhuǎn)移酶β3Gn-T8對(duì)腫瘤細(xì)胞多聚乳糖胺鏈的影響。
　　 方法:
　　 (1)運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法，在人腦星形膠質(zhì)瘤和正常腦組織的石蠟標(biāo)本上，分別檢測(cè)β3Gn-T8的表達(dá)情況并分析其差異。收集相關(guān)膠質(zhì)瘤

3、組織標(biāo)本的臨床病理參數(shù)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析膠質(zhì)瘤β3Gn-T8表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　 (2)將β3Gn-T8的真核表達(dá)正義載體pEGFP-C1-T8及空載體pEGFP-C1、RNA干擾載體pSilenCircle-T8Si及對(duì)照載體pSilenCircle-T8Scr，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入人星形膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定細(xì)胞株，RT-PCR挑選出上調(diào)、下調(diào)β3Gn-T8最優(yōu)的細(xì)胞株。將細(xì)胞分為五組:U251轉(zhuǎn)染

4、正義載體組(T8S)與空載體組(Mock)、U251轉(zhuǎn)染干擾載體組(T8Si)與對(duì)照載體組(T8Scr)、U251未轉(zhuǎn)染組(NC)。RT-PCR、Western blot及免疫熒光檢測(cè)五組細(xì)胞β3Gn-T8的表達(dá)，并用流式細(xì)胞術(shù)分析β3Gn-T8高/低表達(dá)細(xì)胞株的多聚乳糖胺鏈的變化。
　　 (3)在體外實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)MTT檢測(cè)以上各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞單細(xì)胞形成集落的能力;Boyden小室和劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組

5、細(xì)胞侵襲遷移能力差異;采用RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)以上五組細(xì)胞的MMP-2、TIMP-2 mRNA及蛋白水平表達(dá)變化。
　　 (4)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)染正義載體組(T8S)、干擾載體組(T8Si)及未轉(zhuǎn)染組(NC)的U251細(xì)胞通過(guò)皮下接種BALB/c裸鼠的方法構(gòu)建膠質(zhì)瘤移植瘤模型。通過(guò)對(duì)移植瘤成瘤時(shí)間、生長(zhǎng)曲線和最終體積指標(biāo)的測(cè)量以及病理學(xué)觀察，探討β3Gn-T8對(duì)膠質(zhì)瘤移植瘤增殖和侵襲能力的影響。

6、>　　 結(jié)果:
　　 (1)臨床人腦星形膠質(zhì)瘤組織中β3Gn-T8蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為88.10％，顯著高于正常腦組織12.5％(P＜0.01)，且β3Gn-T8蛋白的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的臨床病理分級(jí)正相關(guān)(P＜0.05)。
　　 (2)通過(guò)RT-PCR和Western blot的檢測(cè)，以及激光共聚焦顯微鏡觀察各組細(xì)胞，可見(jiàn)載體成功轉(zhuǎn)入人星形膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)顯示，上調(diào)B3Gn-T8的表達(dá)水

7、平，多聚乳糖胺鏈產(chǎn)量增加，下調(diào)β3Gn-T8的表達(dá)水平，多聚乳糖胺鏈產(chǎn)量減少。
　　 (3)對(duì)轉(zhuǎn)染pEGFP-Cl-T8的U251細(xì)胞進(jìn)行侵襲和增殖能力的系列檢測(cè)，和空載體組相比較，MTT檢測(cè)顯示細(xì)胞的增殖能力升高(P＜0.05)，集落形成實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞集落形成能力增強(qiáng);Boyden小室實(shí)驗(yàn)和劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的侵襲遷移能力增強(qiáng)(P＜0.05);RT-PCR及Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MMP-2的表達(dá)在mRNA水平及蛋白水

8、平相應(yīng)升高(P＜0.05)，而TIMP-2的表達(dá)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 對(duì)轉(zhuǎn)染pSilenCircle-T8Si的U251細(xì)胞進(jìn)行侵襲和增殖能力的系列檢測(cè)，和對(duì)照載體組相比較，MTT檢測(cè)顯示細(xì)胞的增殖能力下降(P＜0.05)，集落形成實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞集落數(shù)明顯降低;Boyden小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞穿膜率較低，侵襲能力弱(P＜0.05)，劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞劃痕修復(fù)較慢，遷移能力下降(P＜0.05);RT-PCR及Western blo

9、t檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MMP-2的表達(dá)在mRNA水平及蛋白水平相應(yīng)降低(P＜0.05)，而TIMP-2的表達(dá)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (4)人星形膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞裸鼠移植瘤成瘤率100％。與NC組相比，T8S組移植瘤成瘤時(shí)間較短，生長(zhǎng)速度較快，最終體積更大(P＜0.05); T8Si組移植瘤成瘤時(shí)間延長(zhǎng)，其生長(zhǎng)速度和最終體積均小于NC組(P＜0.05)。移植瘤組織學(xué)呈現(xiàn)典型的惡性腫瘤細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)，且T8S組的移植瘤細(xì)胞向周圍肌肉組織侵襲生

10、長(zhǎng)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)B3Gn-T8在人星形膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)較正常腦組織顯著增加，其表達(dá)與膠質(zhì)瘤的臨床病理分級(jí)正相關(guān)。
　　 (2)成功構(gòu)建了穩(wěn)定的β3Gn-T8上調(diào)及下調(diào)細(xì)胞株。
　　 (3)β3G n-T8促進(jìn)了多聚乳糖胺鏈的合成。
　　 (4)β3Gn-T8增強(qiáng)了人星形膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖和侵襲能力。
　　 (5)在細(xì)胞水平，隨著β3Gn-T8表達(dá)的上調(diào)，MMP-2的表

11、達(dá)也相應(yīng)升高，而TIMP-2表達(dá)水平不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。β3Gn-T8可能通過(guò)促使多聚乳糖胺鏈的合成，影響MMP-2/TIMP-2比值，打亂了兩者間的平衡，而促進(jìn)了U251細(xì)胞的增殖和侵襲能力。
　　 (6)β3Gn-T8增強(qiáng)了膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤的增殖和侵襲能力。
　　 綜上所述，糖基轉(zhuǎn)移酶β3Gn-T8在人膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的臨床病理分級(jí)正相關(guān);糖基轉(zhuǎn)移酶β3Gn-T8對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力有增強(qiáng)作用;糖基轉(zhuǎn)移