TMPRSS4通過(guò)誘導(dǎo)EMT增強(qiáng)肝細(xì)胞癌侵襲能力的研究.pdf

1、目的:
　　肝癌術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是進(jìn)一步提高人肝癌遠(yuǎn)期療效的瓶頸。已有研究表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymaltransitions，EMT)是人肝癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因，但其作用機(jī)制尚不明確。我們的前期工作發(fā)現(xiàn)，在不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌組織內(nèi)，TMPRSS4及EMT相關(guān)基因產(chǎn)物E-cadherin、vimentin和fibronectin的表達(dá)情況:TMPRSS4表達(dá)高的肝癌組織中E-cadherin表達(dá)降低，

2、而vimentin和fibronectin的表達(dá)升高。提示TMPRSS4與肝癌EMT的發(fā)生可能存在一定的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)著重研究TMPRSS4在肝癌EMT發(fā)生中的作用及其相關(guān)機(jī)制，應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)調(diào)控肝癌細(xì)胞BEL-7402中TMPRSS4的表達(dá)，觀(guān)察TMPRSS4對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移潛能及EMT相關(guān)基因產(chǎn)物表達(dá)的影響，明確TMPRSS4在肝癌EMT發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，從而為預(yù)測(cè)肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和靶向治療提供新的思路。
　　方法:

3、
　　1.構(gòu)建細(xì)胞株
　　構(gòu)建慢病毒載體LV-TMPRSS4，將其轉(zhuǎn)染BEL-7402人肝癌細(xì)胞株，建立過(guò)表達(dá)TMPRSS4的BEL-7402細(xì)胞株。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組
　　實(shí)驗(yàn)組分為正常BEL-7402對(duì)照組(control)、LV-GFP空白載體對(duì)照組(LV-GFP)、LV-TMPRSS4過(guò)表達(dá)組(LV-TMPRSS4)。
　　3.觀(guān)察指標(biāo)
　　BEL-7402人肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒載體LV-TMP

4、RSS4后觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，用RT-PCR及WesternBlot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后TMPRSS4表達(dá)情況。用CCK-8、Transwell、WesternBlot等技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞過(guò)表達(dá)TMPRSS4后其增殖、侵襲能力的變化以及EMT相關(guān)基因產(chǎn)物如E-cadherin、Vimentin、Fibronectin表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.轉(zhuǎn)染后TMPRSS4表達(dá)增強(qiáng)
　　RT-PCR顯示轉(zhuǎn)染后，LV-TMPRSS4組細(xì)胞TM

5、PRSS4mRNA表達(dá)增強(qiáng)。WesternBlot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組和LV-GFP空白載體組比較，LV-TMPRSS4過(guò)表達(dá)組細(xì)胞TMPRSS4蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，而正常對(duì)照組與LV-GFP空白載體組TMPRSS4蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。說(shuō)明人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株BEL-7402轉(zhuǎn)染目的基因TMPRSS4成功。
　　2.BEL-7402細(xì)胞過(guò)表達(dá)TMPRSS4后形態(tài)學(xué)變化
　　BEL-7402人肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV-TMPRSS4后細(xì)胞

6、形態(tài)變化明顯，由原來(lái)的卵石型變?yōu)殚L(zhǎng)梭型。
　　3.BEL-7402細(xì)胞過(guò)表達(dá)TMPRSS4后增殖能力無(wú)明顯變化
　　CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、LV-GFP空白載體對(duì)照組及LV-TMPRSS4過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖能力無(wú)顯著差異(P＞0.05)。說(shuō)明TMPRSS4過(guò)表達(dá)對(duì)BEL-7402細(xì)胞株的增殖無(wú)顯著影響。
　　4.BEL-7402細(xì)胞過(guò)表達(dá)TMPRSS4后遷移能力顯著增強(qiáng)
　　細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞的遷

7、移能力，發(fā)現(xiàn)LV-TMPRSS4過(guò)表達(dá)組細(xì)胞遷移能力顯著加強(qiáng)，而正常對(duì)照組和LV-GFP空白載體對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。
　　5.BEL-7402細(xì)胞過(guò)表達(dá)TMPRSS4后侵襲能力增強(qiáng)
　　transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示LV-TMPRSS4過(guò)表達(dá)組細(xì)胞穿過(guò)Matrigel膠到達(dá)Transwell小室膜背面的細(xì)胞數(shù)為44.0±2.6，顯著高于正常對(duì)照組(15.7±2.1)和LV-GFP空白載體對(duì)照組(16.7±2.1)(P＜0.

8、05)。提示TMPRSS4過(guò)表達(dá)后BEL-7402細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)。
　　6.BEL-7402細(xì)胞過(guò)表達(dá)TMPRSS4后EMT相關(guān)基因產(chǎn)物表達(dá)變化
　　WesternBlot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組和LV-GFP空白載體對(duì)照組相比，LV-TMPRSS4過(guò)表達(dá)組細(xì)胞E-cadherin表達(dá)明顯降低，Vimentin、Fibronectin表達(dá)升高。
　　結(jié)論:
　　1.TMPRSS4過(guò)表達(dá)可使人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株B

9、EL-7402的細(xì)胞形態(tài)由卵石型轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)梭型，利于腫瘤細(xì)胞向周?chē)斑h(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移。
　　2.TMPRSS4過(guò)表達(dá)可顯著增強(qiáng)BEL-7402細(xì)胞的遷移和侵襲能力，但不影響細(xì)胞增殖。
　　3.TMPRSS4過(guò)表達(dá)使BEL-7402細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)降低而Vimentin和Fibronectin表達(dá)升高，提示TMPRSS4可誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞發(fā)生EMT而促進(jìn)肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　4.TMPRSS