超脈沖點陣CO2激光在不同治療參數(shù)下對人體光老化前臂皮膚的臨床及實驗室研究.pdf

1、前言
　　皮膚是最大的人體器官，長期暴露于紫外線(Ultraviolet，UV)的輻射下，可引起皮膚光損傷，包括光老化和皮膚癌。皮膚光損傷主要表現(xiàn)為:皮膚粗糙、松弛、皺紋、不規(guī)則色斑和毛細(xì)血管擴(kuò)張。有多種方法可以實現(xiàn)對光老化皮膚的治療，常見的有:CarbonDioxide(CO2)激光、強(qiáng)脈沖光(intensepulsedlight，IPL)、Erbium∶YAG(Er∶YAG)激光、紅外、射頻等。激光煥膚一直被認(rèn)為是治療皺紋和光

2、老化皮膚的金標(biāo)準(zhǔn)。然而患者會經(jīng)歷水腫、灼傷、結(jié)痂，持續(xù)性紅斑超過6個月。對于深膚色人群來說，長期的色素沉著、感染以及瘢痕的產(chǎn)生，限制了其在亞洲人皮膚治療的應(yīng)用。與剝脫性激光相比，非剝脫性的激光/光雖然不良反應(yīng)輕微，但是在改善皮膚質(zhì)地方面療效不佳。
　　近年來，有學(xué)者提出了點陣化的光熱作用原理，可以在皮膚上產(chǎn)生一個特定深度和密度的微小熱損傷，被稱為微小熱損傷帶(microscopictreatmentzones，MTZs)。MTZs

3、周圍皮膚沒有損傷，使得熱損傷的皮膚可以更迅速的新生。因此，剝脫性點陣激光（尤其是點陣CO2激光）可以產(chǎn)生很好的療效。但與高加索人不同的是，亞洲人容易誘發(fā)炎癥后色素沉著(PIH)。我們現(xiàn)在的研究一方面想觀察超脈沖點陣CO2激光在不同治療參數(shù)下對人體前臂光老化皮膚顏色的影響。
　　Jeffrey等研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白mRNA的表達(dá)與術(shù)前相比，在點陣激光術(shù)后21天及術(shù)后至少6個月分別高達(dá)7.5和8.9倍。而MMPs家族mRNA的

4、表達(dá)在術(shù)后也有明顯的升高。我們的研究希望通過高頻皮膚超聲及鐵蘇木素染色方法，觀察點陣CO2激光在不同參數(shù)治療下，術(shù)后不同時點對皮膚膠原纖維和彈力纖維的影響。使用實時定量PCR方法和免疫組織化學(xué)染色方法，觀察點陣CO2激光對基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)1，3，9，基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑1(tissueinhibitorofmetalloproteinases1，TIMP1)mRNA的表達(dá)

5、水平和蛋白水平的影響。
　　材料與方法
　　一、研究對象
　　招募20名中國女性光老化前臂皮膚受試者，雙側(cè)前臂光老化皮損對稱分布，皮膚類型Ⅱ到Ⅳ型，年齡從38～62歲之間，平均47±8.3歲。排除標(biāo)準(zhǔn):6個月之內(nèi)使用過維A酸類藥物、瘢痕體質(zhì)、懷孕、雙側(cè)前臂皮損不一致。入組前均告知其風(fēng)險、利益、術(shù)后可能的并發(fā)癥，并簽署知情同意書。于術(shù)前、術(shù)后不同時點進(jìn)行病理取材。
　　二、治療前準(zhǔn)備及治療過程
　?。ㄒ唬┲委?/p>

6、前準(zhǔn)備
　　受試者用清水及洗面奶/液清洗雙側(cè)前臂皮膚。溫度20-25℃，濕度40-50％的室內(nèi)休息30分鐘。指定照像室照相(Nikon，Coolpix5700，Tokyo，Japan)，留取受試者前臂皮膚照片。
　?。ǘ┲委熯^程
　　使用超脈沖點陣CO2激光(LumenisOneTM，LumenisLtd，SantaClara,CA，USA)DeepFXTM治療頭掃描一遍進(jìn)行治療。將雙側(cè)前臂曝光部位皮膚平均分為12個

7、區(qū)域，每個區(qū)域5cm×2cm。用不同的治療參數(shù)對每一個區(qū)域進(jìn)行治療。
　　三、療效評價
　?。ㄒ唬┽t(yī)生主觀評價
　　每個治療區(qū)域在治療前、末次治療結(jié)束后3個月、1年后隨訪由醫(yī)生進(jìn)行整體評分。評分標(biāo)準(zhǔn)如下:根據(jù)光老化的4個臨床表現(xiàn)（細(xì)小皺紋、粗糙度、不規(guī)則色斑、整體評估）進(jìn)行10分的評價。
　　（二）受試者滿意度評價
　　于每個治療區(qū)域治療結(jié)束后3個月、1年時進(jìn)行，受試者對其治療區(qū)域療效自評，分為非常滿意、滿

8、意、一般、不滿意四個等級。將非常滿意及滿意計入滿意率。
　　（三）客觀評價
　　1、非創(chuàng)傷性評價
　　雙側(cè)前臂1～12個區(qū)域分別于治療前、術(shù)后5小時，7天，1個月，3個月進(jìn)行黑素指數(shù)(melaninindex，MI)和紅斑指數(shù)（erythemaindex，EI）測定，每個部位測三次，取平均值。并于治療前、術(shù)后1個月、3個月、1年進(jìn)行高頻皮膚超聲測定。
　　2、病理取材皮膚的評價
　　(1)石蠟切片Verho

9、eff鐵蘇木素染色分別觀察真皮膠原纖維或/及彈力纖維含量。
　　(2)石蠟切片，用免疫組織化學(xué)染色方法(SP)法檢測MMP1，3，9，TIMP1的表達(dá)情況。石蠟組織經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、一抗、二抗、顯色并拍照，用Image-Pro-Plus6.0軟件進(jìn)行面積密度(percentagedensity，PD)值及積分光密度平均值（opticaldensity，OD）值測定。
　　(3)采用熒光實時定量PCR方法檢測MMP1，3，9，

10、TIMP1mRNA的表達(dá)。按Takara冰凍組織RNA提取試劑說明書提取總RNA;用Takara.PrimeScriptRTregagentKitPerfectRealTime試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;Takara.SYBRPremisExTaq試劑盒SYBR.Green法進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對定量分析。
　　四、統(tǒng)計學(xué)分析
　　采用SPSS16FORWINDOWS進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。服從正態(tài)分布資料采

11、用t檢驗，服從偏態(tài)分布資料采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗;P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果
　　一、點陣CO2激光對醫(yī)生主觀評分的影響
　　未治療區(qū)域各時間點無差異。與治療前相比，治療區(qū)域治療后3個月、1年評分均有不同程度下降，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。術(shù)后1年時，當(dāng)點陣密度固定，能量逐漸增加時，下降程度更為明顯，當(dāng)能量增加至15-20J/cm2時，再次增加能量評分未見繼續(xù)下降的趨勢。當(dāng)能量固定，密度增加時，

12、下降程度更為明顯。
　　二、受試者滿意度自評
　　治療后3個月，當(dāng)點陣密度固定，能量逐漸增加時，患者滿意率為50％～65％，F(xiàn)25-D5和F30-D5區(qū)域滿意率相對較低，可能系點陣激光術(shù)后3個月依然有少量色素沉著。治療后1年發(fā)現(xiàn)，隨著能量的逐漸增加，患者滿意率也逐漸增高，但當(dāng)能量增加至15-20J/cm2時，患者滿意率基本一致。
　　治療后3個月，當(dāng)能量固定，點陣密度逐漸增加時，患者滿意率為55％～60％，基本一致。治

13、療后1年發(fā)現(xiàn)，隨著點陣密度的逐漸增加，患者滿意率也逐漸增高。
　　三、點陣CO2激光對MI/EI值的變化
　?。ㄒ唬㎝I/EI均值
　　未治療區(qū)域不同時點均未見明顯變化。不同治療區(qū)域MI均值在術(shù)后5小時均有不同程度下降;MI均值在術(shù)后7天均有回升;術(shù)后1個月恢復(fù)到基線水平;治療后3個月隨防時依然升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　不同治療區(qū)域EI均值在術(shù)后5小時均顯著上升;術(shù)后7天依然保持較高水平;術(shù)后1個月有所回降

14、;治療后3個月隨防時保持平穩(wěn)，差異具統(tǒng)計學(xué)意義。
　?。ǘ㎝I/EI差值
　　不同治療區(qū)域MI差值在術(shù)后5小時均變?yōu)樨?fù)值，此時主要是術(shù)后即刻皮膚變紅所致;術(shù)后7天均有很明顯的回升，說明點陣激光術(shù)后7天皮膚表面已經(jīng)有黑色結(jié)痂脫落;術(shù)后1個月恢復(fù)到基線水平，此時的皮膚依然泛紅，所以MI差值不明顯;治療后3個月隨防時依然升高，說明存在PIH。
　　不同治療區(qū)域EI差值在術(shù)后5小時均顯著上升，說明點陣激光術(shù)后即刻存在紅斑腫脹

15、現(xiàn)象;術(shù)后7天依然保持較高水平，此時的紅斑依然較為明顯;術(shù)后1個月有所回降;治療后3個月隨防時保持平穩(wěn)，差異具統(tǒng)計學(xué)意義，說明術(shù)后1-3個月紅斑逐漸消退。
　　四、超聲皮膚厚度/密度的影響
　　（一）皮膚厚度/密度均值
　　不同治療區(qū)域皮膚厚度均值在術(shù)后1個月均顯著上升;術(shù)后3個月下降;術(shù)后1年與治療前相比無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　不同治療區(qū)域皮膚密度均值在術(shù)后1個月均有所升高;術(shù)后3個月升高;術(shù)后1年升高最為明顯。<

16、br>　?。ǘ┢つw厚度/密度差值
　　不同治療區(qū)域皮膚厚度差值在術(shù)后1個月均顯著上升;術(shù)后3個月下降;術(shù)后1年與治療前相比無統(tǒng)計學(xué)差異。術(shù)后1個月，當(dāng)點陣密度固定，差值隨著能量增加，有逐漸增大的趨勢。而術(shù)后3個月及1年時，與術(shù)前相比，雖然沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但是皮膚厚度隨著能量增加，也有逐漸增大的趨勢，間接提示點陣激光隨著能量的增加，可能會使皮膚增厚。當(dāng)能量固定時，點陣密度逐漸增加，術(shù)后1個月，差值隨著密度增加，有逐漸增大的趨勢，可

17、能系術(shù)后1個月依然存在皮膚輕微腫脹，點陣密度越大，腫脹越明顯。術(shù)后3個月差值有所下降，1年時皮膚增厚，但增厚程度與點陣密度無明顯相關(guān)性。
　　不同治療區(qū)域皮膚密度差值在術(shù)后1個月均有所升高;術(shù)后3個月升高;術(shù)后1年升高最為明顯。當(dāng)點陣密度固定時，皮膚密度差值在術(shù)后1個月有所升高，但與能量無明顯相關(guān)性;到了3個月，皮膚密度差值升高，高能量組(F15～F20)處于較高的水平，再次增加能量，皮膚密度未見明顯升高，說明術(shù)后3個月，皮膚已經(jīng)

18、開始增厚;術(shù)后1年，皮膚密度普遍增高明顯，高能量組(F15～F20)處于較高的水平，再次增加能量，皮膚密度未見明顯升高，說明術(shù)后1年皮膚依然可以變得致密，能量到達(dá)F15～F20時，皮膚密度可能已經(jīng)增加到頂峰，無需繼續(xù)增加能量進(jìn)行治療。當(dāng)能量固定時，皮膚密度差值在術(shù)后1個月至3個月有逐漸升高的趨勢，到了術(shù)后1年增高最為明顯，并且隨著點陣密度增加，皮膚密度變得更加致密。
　　五、點陣CO2激光對膠原纖維及彈力纖維的影響
　　術(shù)后

19、3個月至1年，治療區(qū)域膠原纖維面密度及積分光密度均顯著升高。彈力纖維基本與膠原纖維平行，成波浪形排列。當(dāng)點陣CO2激光密度固定，能量逐漸增加時，可以見到膠原纖維及彈力纖維的增多呈上升趨勢。當(dāng)點陣CO2激光能量固定，點陣密度逐漸增加時，可以見到膠原纖維及彈力纖維的增多也呈上升趨勢。
　　六、點陣CO2激光對MMP1，3，9及TIMP1表達(dá)的影響
　?。ㄒ唬┟庖呓M化顯示對MMP1，3，9，TIMP1表達(dá)的影響
　　當(dāng)點陣C

20、O2激光密度固定，能量逐漸增加時，MMP1在治療后5小時已經(jīng)開始表達(dá)，7天時表達(dá)升高，到術(shù)后3個月時依然有少量表達(dá)，術(shù)后1年觀察基本無MMP1蛋白的表達(dá)，這種表達(dá)的變化隨著能量的增加有逐漸增多的趨勢，但當(dāng)能量增加到12.5～15J/cm2時，繼續(xù)增加能量，未見表達(dá)繼續(xù)增多的趨勢。MMP3的表達(dá)與MMP1相似，但術(shù)后3個月表達(dá)依然處于較高水平。MMP9蛋白只在術(shù)后5小時至7天有少量表達(dá)，術(shù)后1個月至1年已基本無表達(dá)，與能量、密度也存在正相

21、關(guān)性。TIMP1在治療后5小時已經(jīng)開始表達(dá)，7天時表達(dá)升高，到術(shù)后3個月時依然有較高的表達(dá)，術(shù)后1年觀察MMP1蛋白依然有少量的表達(dá)，這種表達(dá)的變化隨著能量的增加有逐漸增多的趨勢，但當(dāng)能量增加到15J/cm2時，繼續(xù)增加能量，未見表達(dá)繼續(xù)增多的趨勢。
　　當(dāng)能量固定，密度逐漸增加時，MMP1在術(shù)后5小時開始表達(dá)，7天時表達(dá)升高，到術(shù)后3個月時依然有少量表達(dá)，術(shù)后1年基本無表達(dá)，這種表達(dá)趨勢隨著密度增加有逐漸增加的趨勢。MMP3蛋白

22、的表達(dá)與MMP1的表達(dá)相似，但其三個月時表達(dá)依然處于較高水平。當(dāng)能量固定，隨著點陣密度增加時，發(fā)現(xiàn)TIMP1在治療后5小時至7天時表達(dá)增高，維持高水平至術(shù)后3個月，1年時基本降至正常，并與點陣密度增加呈正相關(guān)。
　　（二）實時定量RT-PCR顯示對MMP1，3，9，TIMP1mRNA表達(dá)的影響
　　當(dāng)點陣CO2激光密度固定，能量逐漸增加時
　　MMP1:不同的治療組合中MMP1mRNA在治療后5小時為表達(dá)高峰。7天時下

23、降，前五種組合（低劑量組）雖較術(shù)前增高，但無統(tǒng)計學(xué)差異;后三種組合（高劑量組）依然較術(shù)前高表達(dá)。MMP1mRNA的表達(dá)呈上升趨勢，不同治療組合之間有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　MMP3:不同的治療組合中MMP3mRNA在治療后5小時為表達(dá)高峰。7天時下降，但依然較術(shù)前表達(dá)增高。MMP3mRNA的表達(dá)呈上升趨勢，不同治療組合之間有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　MMP9:不同的治療組合中MMP9mRNA在治療后5小時為表達(dá)高峰，高劑量組較低劑量組增高

24、明顯，7天時下降，1個月、3個月和1年時基本降至正常。隨著能量的增加，MMP9mRNA的表達(dá)呈上升趨勢，高劑量組較低劑量組上升明顯，不同治療組合之間有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　TIMP1:不同的治療組合中TIMP1mRNA在治療后5小時表達(dá)增高，7天時達(dá)峰值，1個月、3個月和1年時逐漸降至正常。隨著能量的增加，TIMP1mRNA的表達(dá)呈上升趨勢，高劑量組較低劑量組上升明顯，不同治療組合之間有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　當(dāng)能量固定，密度逐漸增加

25、時
　　MMP1:不同的治療組合中MMP1mRNA在治療后5小時達(dá)到高峰，7天時下降，但依然較術(shù)前增高，術(shù)后1個月、3個月至1年時表達(dá)逐漸減少，說明細(xì)胞外基質(zhì)成分降解減少，合成增多。隨著點陣密度的增加，MMP1mRNA的表達(dá)呈上升趨勢，不同治療組合之間有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　MMP3:不同的治療組合中MMP3mRNA在治療后5小時為表達(dá)高峰，7天時下降，但依然較術(shù)前略增高，術(shù)后1個月、3個月至1年時基本降至正常。隨著點陣密度的增

26、加，MMP3mRNA的表達(dá)呈上升趨勢，不同治療組合之間有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　MMP9:不同的治療組合中MMP9mRNA在治療后5小時為表達(dá)高峰，但只有F5-D20治療組較術(shù)前有統(tǒng)計學(xué)差異，7天時下降，1個月、3個月至1年時逐漸降至正常。隨著點陣密度的增加，MMP9mRNA的表達(dá)在不同治療組合之間無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　TIMP1:不同的治療組合中TIMP1mRNA在治療后5小時至7天時表達(dá)增高，達(dá)峰值，術(shù)后1個月、3個月和1年時逐

27、漸降至正常。后三個治療組較第一個治療組上升明顯，不同治療組合之間有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論
　　1、點陣CO2激光治療在短期內(nèi)（3個月內(nèi)）已經(jīng)可以達(dá)到較好的臨床療效，醫(yī)生主觀評分下降，并且隨著點陣能量及密度的增高，滿意率逐漸增高，評分有逐漸降低的趨勢。長期觀察發(fā)現(xiàn)，術(shù)后1年時，臨床療效更加明顯，點陣密度固定時，當(dāng)能量增加至15-20J/cm2時，已經(jīng)可以達(dá)到很好的臨床療效，無需繼續(xù)增加能量進(jìn)行治療;而能量固定時，隨著點陣密度的

28、增加，臨床療效越好。
　　2、點陣CO2激光治療在短期內(nèi)（3個月內(nèi)）可以使得MI/EI升高（多見于高能量密度治療區(qū)域），提示術(shù)后3個月，高能量密度組合依然存在PIH。
　　3、點陣CO2激光通過選擇性光熱作用原理，使光老化皮膚膠原纖維增多、彈力纖維排列正常化，從而在一定程度上恢復(fù)皮膚膠原含量及改善皮膚彈性，達(dá)到治療光老化的目的。
　　4、當(dāng)點陣CO2激光密度固定，能量逐漸增加時，可以見到膠原纖維及彈力纖維的增多呈上升趨