RNA結合蛋白QKI在結腸癌演變中的表達變化及其功能研究.pdf

1、結腸腫瘤全球高發(fā)，每年新增病例100萬，其中50％發(fā)現(xiàn)即為晚期，治療困難，死亡率高。雖然結腸腫瘤演變過程中Wnt通路異常、RAS/RAF突變、p53突變、TGFβ通路異常等重要分子事件序貫發(fā)生的整體框架已經(jīng)基本建立，但是結腸腫瘤治療尚未發(fā)生根本性變化。這一問題的關鍵在于，第一，腫瘤早期診斷缺乏明確的標志物；第二，腫瘤演變中仍有相當數(shù)量的重要分子事件沒有闡明。進一步闡明結腸癌演變過程中重要的分子改變，特別是結腸癌演變過程中早期的分子事件，

2、對結腸癌的防治至關重要。
　　轉錄后調(diào)控作為基因表達的重要調(diào)控方式，參與系統(tǒng)發(fā)生和疾病演變等重要生理和病理過程的調(diào)控。而傳統(tǒng)的基于基因表達芯片的高通量方法主要檢測的是RNA水平的變化，而對機體通過轉錄后調(diào)控方式只影響蛋白水平、而不改變RNA水平的表達變化幾乎無能為力；此時，傳統(tǒng)的對單個基因進行鑒定的研究就顯得尤為重要和必要。
　　RNA結合蛋白QKI屬于STAR家族，由于其上游調(diào)控區(qū)的部分缺失引起少突膠質細胞特異性的QKI表

3、達降低導致神經(jīng)髓鞘形成障礙，小鼠出現(xiàn)嚴重震顫表型，故得名QKI（quaking）。QKI自身存在多種異構體，其中QKI-5主要表達于胚胎時期，定位于細胞核；而QKI-6和QKI-7主要定位于細胞漿。QKI通過識別并結合于mRNA3’UTR上QKI反應元件（QRE，主要是含有NACUAAY-N(1-20)-UAAY的序列特征），來調(diào)節(jié)靶mRNA在細胞內(nèi)的定位、穩(wěn)定性以及翻譯效率等，參與機體生理和病理過程的調(diào)控，如：QKI通過增強MBP、p

4、27的表達、促進MAG的可變剪接，調(diào)控髓鞘的形成。生物信息學顯示QKI能夠調(diào)節(jié)眾多與細胞增殖和分化相關的靶基因，可能扮演抑癌基因的功能。
　　【目的】
　?、偬接慟KI在結腸上皮分化過程中的表達規(guī)律，初步建立QKI的表達與細胞增殖和分化的關系；
　?、诜治鼋Y腸癌中QKI的表達變化，探討QKI在結腸腫瘤中表達異常的機制；
　?、厶接慟KI對結腸癌細胞增殖和分化的影響；
　?、荜U明QKI調(diào)節(jié)結腸癌細胞增殖和分化

5、的主要分子機制，特別是該過程中QKI下游靶分子的篩選和鑒定。
　　【方法和結果】
　?、偈紫缺容^了RNA結合蛋白QKI在結腸上皮分化過程中（自crypt至villi）的表達變化，免疫組化結果顯示QKI在crypt就有表達，隨著細胞分化，QKI整體表達沒有明顯變化；對結腸上皮自crypt至villi進行不同分化程度的細胞進行分離，發(fā)現(xiàn)crypt處細胞表達的QKI主要為QKI-5，而處于villi的細胞則既表達QKI-5又表達Q

6、KI-6；表明在結腸上皮分化過程中，QKI異構體表達存在動態(tài)變化；體外誘導HT29細胞分化，發(fā)現(xiàn)而隨著細胞的分化，QKI-5則早期表達增加，后逐漸降低，而QKI-6則逐漸增加；
　?、谕ㄟ^比較QKI在正常結腸上皮和結腸癌中的表達差異，發(fā)現(xiàn)QKI-5、QKI-6兩種異構體在正常結腸上皮表達較高；而結腸癌細胞系(HT29,SW480,SW620,HCT116,Colo205)和臨床腫瘤樣本中QKI表達普遍有所降低，部分結腸癌細胞QKI

7、表達甚至缺失；
　?、圻M一步分析發(fā)現(xiàn)，QKI啟動子富含CpG島，腫瘤樣本中QKI啟動子甲基化程度與正常細胞相比明顯增高，與基因表達量呈負相關，甲基化酶抑制劑5aza-dC可以部分恢復Colo205細胞中QKI的表達，表明啟動子甲基化是QKI在結腸腫瘤中表達降低的主要原因；
　?、茉诮Y腸癌細胞系HT29過表達QKI-5和QKI-6均可以促進細胞分化標志堿性磷酸酶和乳糖酶的表達；相反RNAi干涉QKI則降低了堿性磷酸酶和乳糖酶的

8、表達，表明在腫瘤細胞系QKI-5和QKI-6均可以促進細胞分化；
　?、萘魇郊毎麅x檢測QKI過表達可以顯著促進細胞撤血清后同步化至G1的效率，延長G1期時長，這可能為細胞分化提供了時間保證；
　?、夼c促進細胞分化相對應，MTT實驗和軟瓊脂克隆形成實驗則證實QKI-5和QKI-6兩種異構體在抑制細胞增殖和克隆形成方面稍有差異，過表達QKI-5微弱抑制細胞增殖和軟瓊脂克隆形成，而過表達QKI-6則能顯著抑制細胞的增殖和軟瓊脂克隆

9、形成的數(shù)量和大??；
　?、邽榱朔治鯭KI調(diào)節(jié)結腸上皮分化發(fā)育和結腸癌演變的具體機制，我們著重探討了QKI對該過程中重要基因p27和β-catenin的可能調(diào)控作用，結果發(fā)現(xiàn)，與文獻報道的一致，QKI-6在結腸癌細胞同樣可以促進p27表達，此外，QKI-5同樣能夠增強p27mRNA穩(wěn)定性、促進p27表達，但QKI-5這種調(diào)控只發(fā)生在細胞過密生長的條件下，這一結果進一步提示QKI這一STAR（signaltransductionand

10、activationofRNA）家族成員對靶基因的調(diào)節(jié)很可能受細胞信號轉導的調(diào)節(jié)；
　?、噙^表達QKI-5和QKI-6均可以增強內(nèi)源β-catenin的細胞膜水平、降低其在細胞漿和細胞核的分布，進而抑制β-catenin的轉錄活性，采用β-catenin的mRNA3’UTR報告系統(tǒng)和RNA的免疫共沉淀實驗確認了QKI與β-catenin存在相互作用，并找到QKI作用的元件，提示QKI在β-catenin等mRNA的定向轉運和局部翻